Simple jQuery Dropdowns
Please use this identifier to cite or link to this item: http://repository.li.mahidol.ac.th/dspace/handle/123456789/1646
Title: Rapid single cell typing using SYBR® Green Real-Time PCR together with Melt Curve analysis for sex identification of porcine sperm
Other Titles: การตรวจเพศอสุจิในระดับเซลล์เดี่ยวแบบรวดเร็วโดยใช้เทคนิคปฏิกริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลทามโดยใช้สีไซบ้ากรีนร่วมกับการวิเคราะห์กราฟของการสลายดีเอ็นเอ
Authors: Varaporn Korchunjit
Kampon Kaeoket
Yindee Kitiyanant
Tuempong Wongtawan
Mahidol University. Faculty of Veterinary Science. Laboratory of Cellular Biomedicine and Veterinary Medicine.
Mahidol University. Faculty of Veterinary Sciences. Semen Laboratory.
Mahidol University. Faculty of Veterinary Science. Department of Clinical science and Public Health.
Mahidol University. Faculty of Science. Department of Anatomy.
Mahidol University. Institute of Molecular Biosciences.
Mahidol University. Faculty of Veterinary Science. Department of Pre-clinic and Applied Animal Science.
Keywords: Pig;Real-time PCR;Sex identification;Single cell;Open Access article;สุกร;ปฏิกริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลทาม;การตรวจเพศอสุจิ;เซลล์เดี่ยว
Issue Date: 2014
Citation: Thai J Vet Med. Vol.44, No.1 (Mar 2014), 41-48
Abstract: Identification of X or Y chromosome is a very useful technique to verify the sex of boar sperm, but common methods used in pig such as Fluorescence In situ Hybridisation (FISH) and whole semen Polymerase Chain Reaction (PCR) have some limitations. FISH is highly accurate, but time-consuming (>3 days). Whole semen PCR is faster than FISH (3-6 h), but not highly accurate (approximate methods). The objective of this study was to develop a fast and highly accurate protocol to identify sex of boar sperm. In the present study, our team developed an alternative sex identification protocol using single cell SYBR® green real-time PCR technique together with low resolution melt curve analysis. Primers specific for chromosome 1 and chromosome Y, a high performance KAPA SYBR® DNA polymerase and Rotor gene PCR platform were used. Male and female single white blood cells were used to calculate sensitivity and specificity. Single sperm was picked up under inverted microscope and transferred to 1 μl of lysis buffer, and real-time PCR was run according to the programmed protocol and analyzed with melt curve analysis. Results showed that our method was a fast (<50 min) accurate method with high sensitivity (95-99%) and specificity (100%) with low percentage of PCR failure (< 3%). Validation of this method using boar whole semen detected Y sperm at 52% and X sperm at 48%, which was comparable to the theory ratio of X and Y sperm (50:50) in semen. It may be concluded that the single cell SYBR® green real-time PCR technique together with melt curve analysis is fast and accurate that can be used to identify sex of boar sperm.
metadata.dc.description.abstractalternative: การตรวจแยกเพศอสุจิ เป็นเทคนิคที่สาคัญที่จะใช้ในการหาปริมาณและอัตราส่วนของเพศตัวอสุจิสุกร แต่เทคนิคที่ใช้กันทั่วไปในการตรวจเพศอสุจิของสุกร เช่น การติดฉลากดีเอ็นเอด้วยสารเรืองแสง (FISH) และการใช้เทคนิคปฏิกริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสตรวจตัวอสุจิเป็นกลุ่มในน้าเชื้อ (whole semen PCR) ยังมีข้อจากัดอยู่หลายอย่าง การติดฉลากดีเอ็นเอด้วยสารเรืองแสงเป็นเทคนิคที่แม่นยา แต่ใช้เวลาในการตรวจนาน(มากกว่า 3 วัน) ในขณะที่การใช้เทคนิคปฏิกริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสตรวจตัวอสุจิเป็นกลุ่มในน้าเชื้อเป็นเทคนิคที่ทาได้เร็วกว่า(ใช้เวลา 3-6 ชม.) แต่มีความแม่นยาน้อยกว่าเพราะเป็นเทคนิคที่ใช้การประมาณการ จุดประสงค์ของการทดลองนี้คือ เพื่อพัฒนาเทคนิคใหม่ที่เร็วกว่าการติดฉลากดีเอ็นเอด้วยสารเรืองแสง แต่แม่นยากว่าการใช้เทคนิคปฏิกริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสตรวจตัวอสุจิเป็นกลุ่มในน้ำเชื้อ ในการทดลองนี้คณะวิจัยได้พัฒนาเทคนิคที่รวดเร็วและแม่นยาในการตรวจเพศอสุจิ โดยใช้เทคนิคปฏิกริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลไทม์กับเซลล์เดี่ยวโดยใช้สีไซบ้ากรีน (single cell SYBR® green real-time PCR) ร่วมกับการวิเคราะห์กราฟการสลายดีเอ็นเอ (Melt curve analysis) โดยใช้ไพรเมอร์ที่จาเพาะต่อโครโมโซม 1 และโครโมโซมวาย เอ็นไซม์ KAPA SYBR®DNA polymerase และ เครื่อง Rotor gene PCR platform ในการทาการทาปฏิกริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส และใช้เซลล์เม็ดเลือดขาวเดี่ยวจากสุกรทั้งเพศผู้และเพศเมียในการวิเคราะห์ความไวและความจาเพาะของเทคนิค จากผลการทดลองพบว่า เทคนิคนี้จะใช้เวลารวดเร็ว (<50 นาที) และแม่นยา โดยความไวของเทคนิคประมาณร้อยละ 95-99 และร้อยละความจาเพาะ 100 มีโอกาสในการวิเคราะห์ตัวอย่างผิดพลาดประมาณ ร้อยละ 3 เมื่อทาการทดสอบกับน้าเชื้อสุกร พบว่าในน้าเชื้อมีตัวอสุจิวายร้อยละ 52 และตัวอสุจิเอ็ก ร้อยละ 48 ซึ่งตรงกับทฤษฎีว่าอัตราส่วนของตัวอสุจิเอ็กและตัวอสุจิวายในน้าเชื้อสุกรจะมีประมาณ 50:50 ผลการทดลองอาจสรุปได้ว่าการตรวจเพศเซลล์อสุจิด้วยเทคนิคปฏิกริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบเรียลทามกับเซลล์เดี่ยวโดยใช้สีไซบ้ากรีนนั้นเป็นเทคนิคที่รวดเร็วและแม่นยา
URI: http://repository.li.mahidol.ac.th/dspace/handle/123456789/1646
metadata.dc.identifier.url: http://www.tci-thaijo.org/index.php/tjvm/article/view/17313
ISSN: 0125-6491
Appears in Collections:VS-Article

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
vs-ar-varaporn-2014.pdf645.76 kBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.