Vichai BoonsaengSakol PanyimAnchalee KamolnavinNusra Sittidilokratna2024-07-052024-07-05199619962024Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 1996https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/99274Biochemistry (Mahidol University 1996)The disadvantages associated with DNA fingerprinting by RFLP and Southern blot analysis of forensic biological samples such as insufficient DNA, degraded DNA can be resolved in part by the polymerase chain reaction (PCR) technique. Various primers including M13 core sequence, 400 RAPD primers as well as primers which amplified 4 variable number of tandem repeat (VNTR) loci were tested for human polymorphisms. Different DNA banding patterns between individuals were observed from amplification of 4 VNTR loci. Four VNTR loci used for amplification of human genomic DNA were: DlS80 located on chromosome lp36-p35; D4S43 located on chromosome 4pl.63; D17S30 located on chromosome 17pl3.3 and APO B located in the 3 flanking region of the apolipoprotein B gene. DNA profiling of each individual was obtained by amplification of these hypervariable loci and subsequent analysis with agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. More than 70 unrelated Thai individuals were studied. The number of alleles detected in the population were 22, 11, 14 and 13 for DlS80, D4S43, D17S30 and APO B VNTR loci respectively. The observed heterozygote frequencies of the loci were 0.81, 0.53, 0.85 and 0.66, for DlS80, D4S43, D17S30 and APO B loci respectively. DNA profiling obtained from amplification of these 4 VNTR loci were used in human population studies, individual identification, paternity and maternity determinations. Moreover, the DNA profiling also provided a powerful method for monitoring bone marrow transplantation in patient with chronic myeloblastic leukemia. Chelex based-DNA extraction of a minute amount of whole blood, blood stain, semen and semen stain which were left at room temperature or refrigerated at 4 degree C up to a period of 4 weeks could be used to generate individual specific DNA profiling. Thus, this technique can also be applied for forensic medicine. DNA profiling by PCR-based method was simple, highly sensitive and rapid. The analysis could be performed within one day compared to approximately 1 week for the conventional Southern blot analysis. Therefore, it can be used for routine analysis in many laboratories.การสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอโดยใช้เอ็นไซม์ตัดจำเพาะ และดีเอ็นเอตรวจตามชนิด M13 ต้องการดีเอ็นเอปริมาณมาก และมีคุณภาพดี แต่เนื่องจากดีเอ็นเอที่ได้จากสิ่งส่งตรวจใน คดีต่าง ๆ มีปริมาณน้อย คุณภาพต่ำ และมีแบคทีเรียปนเปื้อน ซึ่งไม่สามารถนำมาสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอได้ ดังนั้นจึง พัฒนาการสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอโดยอาศัยเทคนิคปฏิกิริยา ลูกโซ่โพลีเมอเรส โดยเลือกใช้ไพรเมอร์ที่สามารถให้ความ แตกต่างระหว่างบุคคลได้ ไพรเมอร์ที่นำมาศึกษาได้มาจาก M13 core sequence, 400 RAPD primers และไพรเมอร์ ที่คร่อมส่วนของ variable number of tandem repeat (VNTR) ในหลาย locus ได้แก่ D1S80 locus ตำแหน่ง 1p36 - p35 ของโครโมโซมที่ 1, D4S43 locus ตำแหน่ง 4p1.63 ของโครโมโซมที่ 4, D17S30 locus ตำแหน่ง 17p13.3 ของโครโมโซมที่ 17 และ APO B locus ตำแหน่ง ปลาย 3 ของยีน apolipoprotein B ผลการทดลองพบว่า ลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่เกิดจาก ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสโดยใช้ไพรเมอร์ที่คร่อมส่วนของ VNTR locus 4 locus และวิเคราะห์ด้วยเทคนิคอีเลคโตร โฟรีซิส สามารถให้ความแตกต่างระหว่างบุคคลได้ จากการ ศึกษาในคนไทย 70 คน พบจำนวน allele ในแต่ละ locus คือ 22, 11, 14 และ 13 สำหรับ D1S80, D4S43, D17S30 และ APO B loci ตามลำดับ ความถี่ของประชากรที่มี heterozygous genotype ในแต่ละ locus คือ 0.81, 0.53, 0.85 และ 0.66 สำหรับ D1S80, D4S43, D17S30 และ APO B loci ตามลำดับ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่ได้จาก ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสของไพรเมอร์ทั้ง 4 คู่นี้ สามารถนำไปประยุกต์ใช้สำหรับการตรวจสอบบุคคล, การตรวจ สอบความเป็นพ่อ แม่ ลูก และใช้ในการติดตามการรักษาการ ปลูกถ่ายไขกระดูกในผู้ป่วยโรคมะเร็งเม็ดโลหิตขาว นอกจาก นี้ได้ทำการปรับปรุงวิธีการสกัดดีเอ็นเอโดยสามารถสกัด ดีเอ็นเอจากเลือด คราบเลือดอสุจิ และคราบอสุจิปริมาณน้อย ๆ ที่เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง และตู้เย็นด้วย Chelex 100 ดีเอ็นเอ ที่สกัดได้สามารถนำมาสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอเพื่อประยุกต์ ใช้ในงานทางนิติเวชวิทยา เนื่องจากการสร้างลายพิมพ์ ดีเอ็นเอใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสมีความไวสูง, ง่าย, รวดเร็ว และสามารถทำได้สำเร็จภายใน 1 วัน ดังนั้น จึงสามารถนำมาประยุกต์ใช้ในห้องปฏิบัติการทั่วไปได้xiv, 136 leaves : ill.application/pdfengผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้าDNA fingerprintingPolymerase Chain ReactionMaster ThesisMahidol University