Prapon WilairatPrayad KomaratatSiripakorn Kasemsant2024-08-062024-08-06199419942024Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 1994https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/100338Biochemistry (Mahidol University 1994)Current studies indicate that the pathophysiology of thalassemic red blood cells is associated with binding of free globin chains to the cell membrane leading to oxidative stress which perturbs membrane organization and finally to rapid clearance of such cells by the reticuloendothelial system. However, problems in the study of oxidative damage in thalassemic red blood cells are complicated by individual variations. Having an in vitro model that mimics thalassemic red blood cells will be useful in determining the detailed effects of oxidative stress on membrane components. In this study, normal red blood cells were oxidized with either phenazine methosulfate, phenylhydrazine or t-butylhydroperoxide. Following oxidation, electrophoretic pattern of membrane proteins were analyzed by SDS-PAGE, the thiol contents of individual membrane proteins were quantitated by radiolabeling with [3H] N-ethylmaleimide and procoagulant activity on the outer surface of red blood cells were measured by prothrombin converting activity assay. In oxidized red blood cells, there were evidences of protein damage as shown by increase in membrane-bound globin, protein degradation and formation of high molecular weight protein complex which was partially reduced by β-mercaptoethanol. Sulfhydryl contents of spectrin and protein 4.1 were decreased in dose-dependent manner. All of these oxidizing agents could induce in a dose-dependent manner the presence of procoagulant activity on the outer surface of red blood cells. These alterations were also observed in thalassemic red blood cell membranes. The degree of changes was highest in splenectomized β-thalassemia/Hb E, followed by nonsplenectomized α-thalassemia/Hb E and α-thalassemia (Hb H disease). In addition, the reduction in the level of lipid antioxidant, vitamin E, also supported the important role of oxidative stress in the pathophysiology of thalassemic red blood cells. Antioxidants, butylated hydroxytoluene (25-200 µM) and d-α-tocopherol (5-40 µM), had partially protective effect on the presence of procoagulant activity on oxidized red cell outer surface but had no effect on the membrane protein damage. To determine the effect of vitamin E status on red blood cell procoagulant activity, one group of β-thalassemia/Hb E patients was supplemented with vitamin E (325 mg daily) for three months and another group received placebo. The results indicated that vitamin E supplementation was not only able to raise the patients plasma vitamin E status but also reduced their red cell procoagulant activity to near normal level. It can be concluded from this study that thalassemic red blood cells were altered by oxidative stress. The degree of red cell membrane damage was highest in splenectomized β-thalassemia/Hb E followed by nonsplenectomized β-thalassemia/Hb E and Hb H disease respectively. Supplementation of vitamin E restored abnormal high procoagulant activity back towards the level of normal control. It is thus suggested that vitamin E may have therapeutic benefit in β-thalassemia/Hb E patients.ในปัจจุบันนี้ได้มีการศึกษามากมายที่บ่งชี้ว่า พยาธิสภาพของเม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยธาลัสซีเมียมีความ เกี่ยวข้องกับการเกาะของสายโกลบินที่เหลือจากการจับ คู่กัน ส่งผลให้เยื่อหุ้มเซลล์มีการเปลี่ยนแปลงซึ่งนำไป สู่การทำลายเม็ดเลือดแดงอย่างรวดเร็ว นับเป็นสาเหตุ สำคัญที่นำไปสู่อาการโลหิตจางในที่สุด ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ตั้งสมมติฐานไว้ว่าการเปลี่ยยแปลงดังกล่าวที่เยื่อหุ้ม เซลล์เม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยธาลัสซีเมียมีสาเหตุมาจาก ขบวนการออกซิเดชั่น และเพื่อเป็นการทดสอบสมมติฐาน ผู้วิจัยจึงทำการเปรียบเทียบผลการเปลี่ยนแปลงของเยื่อ หุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยธาลัสซีเมียกับเยื่อหุ้ม เซลล์ของเม็ดเลือดแดงปกติที่ผ่านการออกซิเดชั่นโดยใช้ สารออกซิไดซิ่ง 3 ชนิด คือ t-butylhydroperoxide, phenazine methosulfate และ phenylhydrazine จากผลการศึกษาพบว่าทั้งเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดงของผู้ ป่วยธาลัสซีเมียและเยื่อหุ้มเซลล์ของเม็ดเลือดแดงปกติ ที่ผ่านการออกซิเดชั่นมีการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายกัน กล่าว คือ ผลของการศึกษาโดยใช้ SDS-PAGE พบว่ามีโกลบินมา เกาะมากขึ้น มีการย่อยสลายของโปรตีน และในขณะเดียว กันก็มีการรวมตัวของโปรตีนโดยพันธะโควาเลนท์ทำให้เกิด โปรตีนขนาดใหญ่และซับซ้อนขึ้น จากการหาปริมาณกลุ่ม sulfhydryl อิสระของโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดง พบว่ากลุ่ม sulfhydryl อิสระของ spectrin+ankyrin และโปรตีน 4.1 มีปริมาณลดลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ส่วนการเปลี่ยนแปลงภายนอกของเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดง พบว่าทั้งเม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยธาลัสซีเมียและเม็ดเลือด แดงปกติที่ผ่านการออกซิเดชั่นมีการเปลี่ยนแปลงไปสามารถ ทำให้ปัจจัยการแข็งตัวของเลือดมาเกาะเกิด prothrombinase complex ซึ่งสามารถเปลี่ยนโปรธรอมบินเป็นธรอมบิน (procoagulant activity) นำไปสู่การเพิ่มการตอบสนองของ เกร็ดเลือดและภาวะขาดออกซิเจนในผู้ป่วยธาลัสซีเมียได้ ในเม็ดเลือดแดงปกติที่ผ่านการออกซิเดชั่นพบว่าความรุนแรง ของการเปลี่ยนแปลงขึ้นกับความเข้มข้นของสารออกซิไดซิ่ง ที่ใช้ ส่วนในเม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยธาลัสซีเมียพบว่า เยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยเบต้าธาลัสซีเมีย/ ฮีโมโกลบินอีที่ตัดม้ามแล้วมีการเปลี่ยนแปลงมากที่สุด รองลงมาคือเม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยเบต้าธาลัสซีเมีย/ฮีโม โกลบินอีที่ยังไม่ตัดม้ามและผู้ป่วยอัลฟ่าธาลัสซีเมีย (ฮีโมโกลบินเอช) ตามลำดับ จากการศึกษาผลของวิตามินอีต่อการเปลี่ยนแปลง ของเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดงของผู้ป่วยเบต้าธาลัสซีเมีย/ ฮีโมโกลบินอีทั้งผู้ที่ตัดม้ามแล้วและยังไม่ตัดม้ามพบว่า การให้ผู้ป่วยรับประทานวิตามินอีวันละ 325 มิลลิกรัม เป็นเวลา 3 เดือน ไม่เพียงทำให้ระดับของวิตามินอี ในพลาสม่าเพิ่มขึ้นเท่านั้น แต่ยังส่งผลให้การเปลี่ยนแปลง ภายนอกของเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดงลดลงทำให้ปัจจัย การแข็งตัวของเลือดมาเกาะน้อยลงอย่างมีนัยสำคัญทาง สถิติอีกด้วย จากการศึกษาในหลอดทดลองพบว่า butylated hydroxytoluene (25-200µM) และวิตามินอี (d-α-tocopherol) (5-40 µM) ซึ่งมีคุณสมบัติ ยับยั้งการเกิดขบวนการออกซิเดชั่นสามารถลดการเกิด procoagulant cativity ได้บางส่วนแต่ไม่มีผลต่อ การเปลี่ยนแปลงของโปรตีน จากข้อมูลเหล่านี้สามารถสรุปได้ว่าเม็ดเลือดแดง ของผู้ป่วยธาลัสซีเมียมีโดยเฉพาะอย่างยิ่งผู้ป่วยเบต้า ธาลัสซีเมีย/ฮีโมโกลบินอีที่ตัดม้ามแล้วมีภาวะเครียด ออกซิเดชั่นเพราะนอกจากจะมีการเปลี่ยนแปลงต่าง ๆ ที่ คล้ายกับการเปลี่ยนแปลงที่พบในเม็ดเลือดแดงปกติที่ผ่าน การออกซิเดชั่นแล้ว ระดับของวิตามินอีในพลาสม่ายังมี ระดับต่ำลงอีกด้วย แต่อย่างไรก็ตามการให้ผู้ป่วยรับประทาน วิตามินอีมีผลช่วยยับยั้งการกระตุ้นการทำงานของปัจจัย การแข็งตัวของเลือดซึ่งอาจจะมีผลช่วยรักษาภาวะขาด ออกซิเจนในผู้ป่วยธาลัสซีเมียได้xii, 171 leaves : ill. (some col.)application/pdfengผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้าbeta-ThalassemiaErythrocyte membraneMaster ThesisMahidol University