Tararaj DharakulMetawee Thongdee2023-08-312023-08-31200820232008Thesis (Ph.D. (Immunology))--Mahidol University, 2008https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/89071Burkholderia pseudomallei, a saprophytic Gram-negative bacillus is the causative agent of melioidosis. The mechanisms contributing to B. pseudomallei virulence need to be Genomic comparison by elucidated to understand the pathogenicity of this organism. subtractive hybridization was performed between virulent B. pseudomallei and the closely related nonvirulent B. thailandensis to identify potential virulence genes unique to B. pseudomallei. DNAs of both species were hybridized and the hybrid sequences were then removed. Consequently, the remaining unhybridized DNAs represented genes that were present in B. pseudomallei but were absent from B. thailandensis. The products of the subtractive hybridization were used to construct a subtracted library of B. pseudomallei. Eighty-six individual clones were generated in the subtracted library; the majority was specific to B. pseudomallei. A majority of these clones were mapped to genes within genomic islands or island-like regions, although almost half of these clones represented hypothetical genes with unknown functions. The remaining clones represented genes whose products were proteins with known functions including proteins involved in virulence such as proteins for capsule production, proteins of type III secretion system, exoproteins, adhesins and fimbriac. These unique genes are likely to play an important role in the development of B. pseudomallei virulence. To understand their role in the pathogenicity of B. pseudomallei, a novel procedure was developed for generating deletion mutations by natural transformation in B. pseudomallei and also B. thailandensis. The procedure utilized fragments carrying selectable markers flanked by regions of homology oriented such that homologous recombination replaced genomic sequences with the selectable marker. Deletion mutants were confirmed for the presence of the appropriate insertion and loss of the targeted wild type sequences by PCR. This procedure was also applied to transfer chromosomal DNA for generating deletion mutations in both species. The antibiotic resistance marker used for mutant selection can be removed from the genome by site-specific excision allowing reutilization of the marker for genetic selection and phenotype examination without marker effects. Moreover, the donor DNA, in the form of either PCR fragment or chromosomal DNA, can be transferred within the same species and between B. pseudomallei and B. thailandensis. These procedures for creating targeted gene knock-out mutations and moving them between strains should facilitate genetic analysis of virulence genes including those identified in the subtractive hybridization studies.Burkholderia pseudomallei เป็นเชื้อแบคทีเรียกรัมลบ รูปแท่ง พบในดิน ซึ่งเชื้อนี้เป็นสาเหตุของโรคเมลีออยโดสิส ความสามารถในการพัฒนาความรุนแรงของเชื้อนี้ยังคงต้องการการศึกษาเพื่อทำความเข้าใจกลไกการต่อโรค ในการศึกษานี้ได้ทำการเปรียบเทียบสารพันธุกรรมของเชื้อ B. pseudomallei สายพันธุ์ที่ก่อโรคกับเชื้อ B. thailandensis สายพันธุ์ที่ไม่ก่อโรคโดยวิธี subtractive hybridization โดยสารพันธุกรรมของเชื้อทั้งสองที่มีความเหมือนกันจะถูกคัดออกให้เหลือแต่สารพันธุกรรมที่พบเฉพาะใบเชื้อ B. pseudomallei และไม่พบในเชื้อ B. thailandensis สารพันธุกรรมที่ได้จะนำไปสร้างเป็น subtracted library ของเชื้อ B. pseudomallei subtracted library ที่ได้มีโคลนที่มีสารพัธุกรรมของเชื้อ B. pseudomallei ที่แตกต่างกับจำนวน 86 ชิ้น และชิ้นของสารพันธุกรรมดังกล่าวส่วนใหญ่มีความจำเพาะกับเชื้อ B. pseudomallei ชั้นของสารพันธุกรรมส่วนใหญ่ตรงกับยืนที่อยู่ในบริเวณของ genomic islands or genomic islands-like ของอีโนม ซึ่งเกือบครึ่งเป็นยืนของโปรตีนที่ไม่ทราบหน้าที่ และส่วนที่เหลือเป็นยีนของโปรตีนที่ทราบหน้าที่โดยเฉพาะโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการความรุนแรงของเชื้อได้แก่ โปรตีนสำหรับการสร้างแคปซูล, โปรตีนของ type III secretion system, exoprotein, adhesin และ fimbriae ทั้งนี้ยืนที่จำเพาะดังกล่าวนำจะมีส่วนสำคัญในการพัฒนาความรุบแรงของเชื้อ B. pseudomallei การศึกษาหน้าที่การทำงานของยืนที่นำจะมีส่วนเกี่ยวข้องกับความรุนแรงของเชื้อ B. pseudomallei จะช่วยให้เกิดความเข้าใจในการก่อโรคเมลีออยโคสิส และเพื่อประโยชน์ของการศึกษาดังกล่าว จึงได้มีการพัฒนาเทคนิคเพื่อทำให้ยืนที่สนใจของเชื้อ B. pseudomallei และ B. thailandensis สูญเสียการทำงานโดยอาศัย natural transformation ของชิ้น PCR โดยชิ้น PCR ดังกล่าวประกอบด้วย ยีบของยาปฏิชีวนะที่ใช้เป็นตัวคัดเลือกโคลนที่มีการสูญเสียยืนที่สนใจขนาบด้วยชิ้นของสารพันธุกรรมที่เป็นบริเวณส่วนต่อของยืนที่สนใจ หลังจากชิ้น PCR ถูกนำเข้าสู่เชื้อ B. pseudomallei และ B. thailandensis แล้ว ชิ้น PCR ดังกล่าวจะแทรกเข้าสู่ยีโนมของ Burkholderia โดยจะแทนที่ยืนทีสนใจด้วยยีนของยาปฏิชีวนะ ทำให้เกิดการกลายพันธุ์และสูญเสียการทำงานของยืนที่สนใจซึ่งเชื้อที่ถูกทำให้กลายพันธุ์จะได้รับการยืนยันการสูญเสียยีนที่สนใจซึ่งถูกแทนที่ด้วยยืนของยาปฏิชีวนะด้วยเทคนิค PCR นอกจากนี้ยังพบว่าโครโมโซมของเชื้อที่กลายพันธุ์สามารถใช้เพื่อถ่ายทอดการกลายพันธุ์ระหว่างสายพันธุ์ได้ด้วยเทคนิคข้างต้น เนื่องจากเทคนิคนี้ใช้ยืนของยาปฏิชีวนะเพื่อแทนที่ยืนที่สนใจและเพื่อคัดเลือกเชื้อที่มีการกลายพันธุ์ อย่างไรก็ตามยืนของยาปฏิชีวนะดังกล่าวสามารถถูกตัดออกจากยีโนมโดยใช้เอนไซม์ที่จำเพาะ ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการนำยืนของยาปฏิชีวนะดังกล่าวกลับมาใช้ได้อีกและสามารถศึกษาผลที่เกิดจากการสูญเสียยืนที่สนใจโดยปราศจากผลกระทบที่อาจเกิดจากยืนของยาปฏิชีวนะที่แทรกอยู่ในยีโนมได้ นอกจากนี้เทคนิคดังกล่าวยังสามารถถ่ายทอดการกลายพันธุ์ในสายพันธุ์เดียวกันหรือระหว่างเชื้อ B. pseudomallei และ B. thailandensis โดยการใช้ชิ้น PCR หรือ โครโมโซมทั้งนี้เทคนิคที่พัฒนาได้ดังกล่าวน่าจะช่วยในการศึกษาวิเคราะห์ยืนที่เกี่ยวข้องกับการก่อโรครวมทั้งยีนที่จำเพาะกับเชื้อ B. pseudomallei ที่ได้จากการทำ subtractive hybridization ข้างต้นxx, 234 leaves : ill.application/pdfengผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้าBurkholderia pseudomalleiGenomeMelioidosisDoctoral ThesisMahidol University