Skorn MongkolsukPaiboon VattanaviboonAdisak RomsangKhwannarin Khemsom2024-01-042024-01-04201820182024Thesis (M.Sc. (Biotechnology))--Mahidol University, 2018https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/91743Biotechnology (Mahidol University 2018)Transfer RNA (tRNA) is an important player for genetic translation. TtcA is one of tRNA modifying enzymes that thiolates nucleoside to regulate protein production. In this study, the physiological function of putative ttcA in pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa (PAO1) was characterized. The PAO1 genome contains a gene PA1192 encoding a tRNA 2-thiocytidine biosynthesis protein (TtcA) and has the highest similarity to a known Escherichia coli TtcA. The protein properties of P. aeruginosa TtcA were investigated. Our results showed that TtcA contained [Fe-S] cluster, which is a target of reactive oxygen species (ROS) and exhibited a dosedependent decrease in the cofactor binding stability against ROS. Either lacking of functional TtcA or [4Fe-4S] cluster malfunction leads to hydrogen peroxide (H2O2) susceptibility. Since catalases are major protections against H2O2 in bacteria, the catalase activities in the ttcA deficiency strain were observed. We found the lower KatA activity in the ttcA mutant indicated a role of ttcA in a part of KatA detoxification rather than other catalase, KatB. Moreover, the double ΔkatAΔttcA mutant was a confirmed physiology function of katA via ttcA under H2O2 treatment. The result had no significant difference between ΔkatA mutant and ΔkatAΔttcA mutant susceptibility which suggested that ttcA could function in a part of KatA activity. In addition, gene expression profile of ttcA deficiency strain was investigated. Deletion of ttcA caused an increase in the katA expression by using Real time RT-PCR but 0.45-fold decreased amount of KatA by using Western blot analysis. This indicated that lacking of ttcA affect H2O2 detoxification through KatA in post-transcriptional step. This study demonstrated a novel mechanism in post-transcriptional regulation via TtcA for cell survival under host-generated stress conditions in this pathogenic bacterium.อาร์เอ็นเอถ่ายโอน (Transfer RNA หรือ tRNA) เป็นตัวกลางสำคัญในแปลรหัสทางพันธุกรรม โดยนำกรดอะมิโนที่ถูกต้องมาเรียงต่อกันเพื่อสังเคราะห์เป็นโปรตีนอนุพันธ์ของ tRNA ที่เกิดจากการดัดแปลงมีหน้าที่เฉพาะที่แตกต่างกัน การเติมหมู่ไทออล (Thiolation) เป็นการดัดแปลง tRNA ที่มีการศึกษาอย่างแพร่หลายและมีรายงานว่า การดัดแปลง tRNA มีอิทธิพลต่อปริมาณการสังเคราะห์โปรตีน ในการศึกษานี้ ได้ใช้เชื้อแบคทีเรียก่อโรค สูโดโมนาส แอรูจิโนซา (Pseudomonas aeruginosa) เป็นโมเดลเพื่อวิเคราะห์ผลจากการทางานของโปรตีน TtcA ซึ่งมีหน้าที่เติมหมู่ไทออลเพื่อดัดแปลง tRNA ต่อการดำรงชีวิตภายใต้สภาวะออกซิเดชั่น การศึกษาลักษณะของโปรตีนโดยใช้เทคนิค Spectroscopy พบว่าโปรตีน TtcA ต้องการ Fe-S cluster เป็น cofactor สาหรับการทำปฏิกิริยา Thiolation และใช้แบคทีเรียที่ลบยีน ttcA เพื่อศึกษาบทบาทที่เกี่ยวข้องต่อความอยู่รอดภายใต้สารก่อออกซิเดชั่น ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ แบคทีเรียที่ลบยีน ttcA ทนต่อไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ได้น้อยกว่าพันธุ์ดั้งเดิมการขจัดพิษจากไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นผลมาจากการทางานของเอนไซม์คะตาเลสเป็นหลัก จากการทดสอบ พบว่าแบคทีเรียที่ลบยีน ttcA มีกิจกรรมของเอนไซม์คะตาเลสในเซลล์ลดลง 39% โดยเป็นผลมาจากเอนไซม์คะตาเลสเอ (KatA) มีกิจกรรมลดลง 25% ซึ่งสอดคล้องกับปริมาณโปรตีน KatA ที่ลดลง 45% ในขณะที่การแสดงออกของอาร์เอ็นเอนำรหัส (messenger RNA หรือ mRNA) กลับมากขึ้น 2.79 เท่าเมื่อเทียบกับสายพันธุ์ดั้งเดิม ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า TtcA ควบคุมการแสดงออกของโปรตีน KatA ในระหว่างการสังเคราะห์โปรตีน การศึกษาโดยใช้เทคนิค Site-directed mutagenesis พบว่าโปรตีน TtcA ต้องการกรดอะมิโน Cysteine สี่ตัว (C115, C118, C203 และ C206) ในการทำหน้าที่ให้สมบูรณ์เพื่อความอยู่รอดของเซลล์ โดยสรุปของการศึกษานี้เป็นการค้นพบกลไกการควบคุมการแสดงออกในขณะแปลรหัสทางพันธุกรรมเพื่อตอบสนองสภาวะอันตรายรอบตัวอย่างว่องไว และ สามารถนำข้อมูลไปพัฒนาสร้างสารต้านการเจริญของเชื้อก่อโรคแบบใหม่ หรือค้นหาสารสำคัญเพื่อช่วยส่งเสริมให้ยาฆ่าเชื้อมีประสิทธิภาพมากขึ้นxvi, 117 leaves : ill.application/pdfengผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้าGenetic regulation -- Laboratory manualsTransfer RNARNA Processing, Post-TranscriptionalMahidol University