Leera KittigulKannika Pombubpa2025-03-112025-03-11200620252006Thesis (M.Sc. (Infectious Diseases and Epidemiology))--Mahidol University, 20069740478387https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/106615Infectious Diseases and Epidemiology (Mahidol University 2006)Viral foodborne diseases are significant public health problem. Outbreaks of viral gastroenteritis have been reported and associated with consumption of raw or slightly cooked oysters. Identification of viruses in outbreak-implicated shellfish have been difficult because of low levels of contamination, and natural inhibitors in shellfish tissues. In this study, a method for concentration of rotavirus was developed for detection of the virus from oysters. Three different concentration methods were compared: direct alkaline elution, acid adsorption-neutral elution, and acid adsorption-alkaline elution. Rotavirus was seeded into oyster meat, concentrated, extracted for RNA, and examined using reverse transcriptase-nested polymerase chain reaction (RT-nested PCR). The results showed that the acid adsorption-alkaline elution gave the highest sensitivity of rotavirus detection (3.12 x 10(3) infectious forming units [IFU]/25 g or 125 IFU/g) followed by the acid adsorption-neutral elution (1.25 x 10 IFU/25 g), and direct alkaline elution (2.5 x 10(4) IFU/25 g). The acid adsorption-alkaline elution process included acid adsorption at pH 4.8, elution with 2.9% tryptose phosphate broth containing 6% glycine pH 9.0, twice polyethylene glycol precipitation, chloroform extraction, and speedVac reconcentration. From August 2005 to February 2006, 120 oyster samples were collected from local markets in Bangkok (60 samples) and oyster farms in Surat Thani Province (60 samples). All raw oyster samples were concentrated using the acid adsorption-alkaline elution and determined for rotaviruses using RT-nested PCR. Rotaviruses were found in four oyster samples, one from the local market and three from the oyster farms. PCR products (346 basepairs) were sequenced and analysed for their phylogenetic tree. It was found that the oyster samples contained rotavirus sequences associated with human rotavirus genotypes G9 (two samples), G3 (one sample), and G1 (one sample). This study recommends acid adsorption-alkaline elution as the virus concentration method and RT-nested PCR for detection of rotaviruses from oyster samples due to its high sensitivity. Data of rotavirus genotypes contaminated in oyster samples would be useful for epidemiological study and microbiological risk assessment.โรคติดเชื้อไวรัสที่เกิดจากอาหารเป็นสื่อ เป็นปัญหาสำคัญทางสาธารณสุข มีรายงานการระบาดจากการรับประทานหอยนางรมดิบหรือปรุงไม่สุก การตรวจไวรัสปนเปื้อนในหอยทำได้ยากเพราะในธรรมชาติมีไวรัสอยู่ในปริมาณน้อยและอาจมีสารยับยั้งในเนื้อหอย การศึกษานี้เป็นการพัฒนาวิธีทำให้ไวรัสโรตาเข้มข้นจากหอยนางรม โดยเปรียบเทียบ 3 วิธี คือ direct alkaline elution, acid adsorption-neutral elution และ acid adsorption-alkaline elution ทำการทดลองเติมไวรัสโรตาในหอยนางรม ทำให้ไวรัสเข้มข้น แยกสกัดอาร์เอนเอ และตรวจด้วยวิธี reverse transcriptase-nested polymerase chain reaction (RT-nested PCR) พบว่า วิธี acid adsorption-alkaline elution ให้ความไวสูงสุดสามารถตรวจไวรัสโรตาได้น้อยที่สุด 3.12 x 10(3) infectious forming units (IFU)/25 g หรือ 125 IFU/g รองลงมาคือวิธี acid adsorption- neutral elution (1.25 x 10(4)IFU/25 g) และ direct alkaline elution (2.5 x 10(4) IFU/25 g) ตามลำดับ วิธี acid adsorption-alkaline elution มีขั้นตอนดังนี้ ดูดซับไวรัสที่ pH 4.8 ชะไวรัสด้วย 2.9% tryptose phosphate broth ที่มี 6% glycine pH 9.0 ตกตะกอนไวรัสสองครั้งด้วย polyethylene glycol แยกสกัดไวรัสด้วยคลอโรฟอร์ม ตามด้วยการปั่นภายใต้สุญญากาศเพื่อลดปริมาตร ได้นำวิธีนี้ไปตรวจกับตัวอย่าง หอยนางรมทั้งหมด 120 ตัวอย่าง ซึ่งเก็บตัวอย่างระหว่างเดือนสิงหาคม พ.ศ. 2548 ถึงเดือนกุมภาพันธ์ พ.ศ. 2549 จากตลาดสด ในกรุงเทพมหานครจำนวน 60 ตัวอย่าง และ จากฟาร์มหอยนางรมในจังหวัดสุราษฎร์ธานีจำนวน 60 ตัวอย่าง โดยทำให้ไวรัสเข้มข้นด้วยวิธี acid adsorption-alkaline elution และ ตรวจโดยใช้วิธี RT-nested PCR ผลการทดลองพบไวรัสโรตาในหอยนางรม 4 ตัวอย่าง มาจากตลาดสดหนึ่งแห่ง และมาจากฟาร์มหอยนางรมสามแห่ง นำ PCR products ขนาด 346 basepairs ไปตรวจลำดับ นิวคลีโอไทด์และวิเคราะห์ phylogenetic tree พบว่ามีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สัมพันธ์กับ ไวรัสโรตาก่อโรคในคน จีโนทัยป์ G9 สองตัวอย่าง G3 และ G1 อย่างละหนึ่งตัวอย่าง การศึกษาครั้งนี้เสนอแนะว่า การทำให้ไวรัสเข้มข้นด้วยวิธี acid adsorption-alkaline elution และตรวจอาร์เอนเอด้วยวิธี RT-nested PCR มีประสิทธิภาพสูงในการตรวจไวรัสโรตาจากหอยนางรม สำหรับข้อมูลจีโนทัยป์ของไวรัสโรตาที่ปนเปื้อนในหอยนางรมจะเป็นประโยชน์ต่อการศึกษาด้านวิทยาการระบาดและการประเมินความเสี่ยงทางจุลชีววิทยาของหอยนางรมต่อไปvii, 100 leaves : ill.application/pdfengผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้าOyster cultureRotavirusVirusesMaster ThesisMahidol University