Pa-thai YenchitsomanusMutita JunkingAussara PanyaPatta Phumesin2024-01-032024-01-03201720172024Thesis (Ph.D. (Immunology))--Mahidol University, 2017https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/91656Immunology (Mahidol University 2017)Dengue virus (DENV) infection is a worldwide public health problem. It can cause a spectrum of clinical manifestations ranging from mild dengue fever (DF), severe dengue hemorrhangic fever (DHF), and potentially life-threatening disease, dengue shock syndrome (DSS). Currently, there is no availability of a specific antiviral drug for DENV infection. Thus, anti-DENV agent that can inhibit all four DENV serotypes is urgently needed. In this study, antisense oligonucleotides, vivo-morpholinos oligomers (vivo-MOs), that target to the top of 3' stem-loop (3' SL) at 3' UTR of DENV genome were tested for inhibition of DENV infection. The interaction between vivo-MOs and DENV RNA was studied by oligonucleotide binding assay. The inhibition of viral replication and production were examined in DENV-infected cell lines, including monkey kidney epithelial (Vero) cell, human lung epithelial carcinoma (A549) cells, and human immature monocyte-derived dendritic cells (MDDCs). The results of oligonulcleotide binding assay showed that vivo-MO-1 specifically bound to DENV RNA. Treatment of vivo-MO-1 significantly reduced viral RNA, viral protein, viral infectivity, and viral production in DENV-2-infected Vero cells. Furthermore, the inhibitory effect were also observed in DENV-1, 3, and 4 infected Vero cells suggesting the potential of vivo-MOs to inhibit four DENV serotypes. However, vivo-MO-1 had less activity to inhibit DENV4 infection which might be caused by 5-base pair mismatch to DENV4 genome sequence. For this reason, vivo-MO-2 was designed to completely complementary match to DENV-4 sequence. As expected, the result showed that vivo-MO-2 had greater inhibitory activity than vivo-MO-1 to inhibit viral production and viral infection in DENV-4 infected Vero cells. The vivo-MOs activity has been testes in other target cell types, A549 and MDDCs. The results showed that vivo-MOs were effectively inhibited viral infection and viral production in DENV-2 infected A549 cells. Furthermore, vivo-MOs significantly reduced viral RNA, viral protein, viral infection and viral production in DENV-2 infected MDDCs. Taken together, vivo-MOs at submicromolar concentration was nontoxic and sufficient to effectively inhibit DENV infection in Vero cells, A549 cells, and MDDCs. This study supports further development of vivo-MOs as anti-DENV inhibitors targeting to DENV RNA.โรคไข้เลือดออกเป็นปัญหาสาธารณสุขสำคัญของหลายประเทศทั่วโลก อาการของโรคไข้เลือดออก สามารถจำแนกจากรุนแรงน้อย จนถึงขั้นทาให้เสียชีวิต ได้แก่ dengue fever (DF), dengue hemorrhangic fever (DHF), และ dengue shock syndrome (DSS) ในปัจจุบันโรคไข้เลือดออกมีวัคซีนสำหรับป้องกัน แต่ยังไม่มียาสำหรับรักษา ดังนั้นจึงมีความจำเป็นที่จะต้องค้นหายาต้านไวรัสเด็งกีที่สามารถยังยั้งไวรัสได้ทั้ง 4 ซีโรทัยป์ ในงานวิจัยนี้ ผู้วิจัยได้ศึกษาสารต้านเชื้อไวรัสเดงกีโดยมุ่งเป้าที่อาร์เอ็นเอของไวรัส สารต้านการติดเชื้อไวรัสเด็งกีที่ทำการศึกษาคือ vivo-morpholinos (vivo-MOs) ซึ่งสามารถจับกับส่วนบนของ 3' stem-loop (3' SL) ในบริเวณ 3' UTR ในจีโนมของเชื้อไวรัสเด็งกี โดยทาการทดสอบประสิทธิภาพของ vivo-MOs ในการยับยั้งเชื้อไวรัสเด็งกีในเซลล์เพาะเลี้ยง 3 ชนิด คือ Vero cells, A549 cells และ human immature monocyte-derived dendritic cells (MDDCs) ผลการทดลองพบว่า vivo-MO-1 สามารถจับกับอาร์เอ็นเอของไวรัสเชื้อเด็งกีได้ และมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเพิ่มจำนวนของ viral RNA, viral protein, viral infection และ viral production ใน Vero cells ที่ติดเชื้อไวรัสเด็งกีซีโรไทป์ 2 อีกทั้งยังมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเพิ่มจำนวนของ DENV-1, DENV-3 และ DENV-4 ด้วย อย่างไรก็ตาม vivo-MO-1 สามารถยับยั้ง DENV-4 ได้มีประสิทธิภาพต่ำ ซึ่งน่าจะเกิดจากการมีการมีเบสที่ไม่สามารถจับกันได้ 5 ตำแหน่ง จึงจำเป็นต้องมีการออกแบบและสังเคระห์ vivo-MO-2 ให้จับได้อย่างสมบูรณ์กับ DENV-4 ซึ่งพบว่ามีประสิทธิภาพในการยับยั้ง DENV-4 ได้ดีกว่า vivo-MO-1 นอกจากนี้ยังพบว่า vivo-MOs มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการติดเชื้อและการสร้างไวรัสเด็งกีใน A549 cells และมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเพิ่มปริมาณและจำนวนของ viral RNA, viral protein, viral infection และ viral production ใน MDDCs ผลการศึกษานี้สรุปได้ว่า vivo-MOs ในปริมาณความเข้มข้นระดับ submicromolar ที่นำมาทำการศึกษา ไม่เป็นพิษต่อเซลล์เพาะเลี้ยงและสามารถยับยั้งการติดเชื้อไวรัสเด็งกีได้อย่างมีประสิทธิภาพในเซลล์ชนิด Vero, A549, และ MDDCs การศึกษานี้จึงสนับสนุนการพัฒนา vivo-MOs ต่อไป เพื่อเป็นยาต้านไวรัสเด็งกีโดยมุ่งที่อาร์เอ็นเอของไวรัสxiv, 106 leaves : ill.application/pdfengDengue VirusOligomers -- Laboratory manualsOligonucleotides, AntisenseMahidol University