Chanan AngsuthanasombatKatzenmeier, GerdChalermpol KanchanawarinSomphob LeetachewaChompounoot Imtong2023-09-082023-09-08201420142023Thesis (Ph.D. (Molecular Genetics and Genetic Engineering))--Mahidol University, 2014https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/89534The long loop connecting transmembrane helices 4 and 5 of the Bacillus thuringiensis Cry4Aa toxin possesses unique structural features including a proline-rich sequence (Pro[superscript]193Pro[superscript]194_Pro[superscript]196) which was previously shown to be crucial for mosquito-larvicidal activity. In this study, the structural importance of the proline-rich region was further clarified. Initially, the three proline residues (Pro[superscript]193, Pro[superscript]194 and Pro[superscript]196) were substituted individually with valine, a hydrophobic residue with size similar to proline, and the resulting mutants were expressed in Escherichia coli cells at levels similar to that of the wild-type toxin. Bioassays demonstrated that E. coli cells expressing each mutant toxin exhibited a reduction in toxicity against Aedes aegypti mosquito larvae, suggesting an important role in toxin function of unique cyclic structure, not hydrophobic feature, of the loop proline residues. Molecular dynamics (MD) simulations of the 65-kDa Cry4Aa structure in 150 mM KCl solution revealed that the α4-α5 loop is substantially stable as it showed a low structural fluctuation with RMSF value of 1.2 A. When the α4-α5 loop flexibility was increased through P193G, P194G and P196G mutations, a decrease in larvicidal activity was also observed for all mutants, suggesting that loop rigidity provided by cyclic side chain of proline residues is functionally important. Further structural analysis via MD simulations revealed that only the most critical proline residue, Pro[superscript]193, at which mutations adversely affect toxin solubility is in close contact with several surrounding residues, thus playing an additional role in structural arrangement of the Cry4Aa toxin molecule. Altogether, present data suggest that structural stability of the Cry4Aa α4-α5 loop comprising the proline-rich sequence plays an essential role in the toxin functionส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 ของโปรตีนสารพิษ Cry4Aa มีลักษณะเฉพาะอันประกอบด้วย rich sequence ที่พบว่ามีความสำคัญต่อการฆ่าลูกนํ้ายุงของโปรตีนนี้ งานวิจัยนี้ได้ศึกษาต่อยอดถึงความสำคัญเชิงโครงสร้างของ rich region ซึ่งเริ่มต้นด้วยการสร้างโปรตีนกลายพันธุ์ P193V, P194V และ P196V ที่ยังคงลักษณะความไม่ชอบนํ้าของกรดอะมิโนทั้งสามตำแหน่งไว้และพบว่าปริมาณการสร้างโปรตีนขนาด 130 กิโลดาลตันของโปรตีนกลายพันธุ์ทั้งสามชนิดในเชื้อ Eschericia coli นั้นเท่ากับของโปรตีนต้นแบบ (wild type) ซึ่งเมื่อนำไปทดสอบความสามารถในการฆ่าลูกนํ้ายุงลาย Aedes aegypti พบว่า E. coli ที่สร้างโปรตีนกลายพันธุ์ทั้งสามชนิดสูญเสียความเป็นพิษต่อลูกนํ้ายุงลายอย่างมีนัยสำคัญ ชี้ให้เห็นว่าความไม่ชอบนํ้าของ proline เพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอต่อความเป็นพิษของโปรตีน การจำลองการเคลื่อนไหวของโปรตีน Cry4Aa ในสารละลาย KCl แสดงให้เห็นว่าส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 มีความเสถียรอย่างมาก และเมื่อศึกษาเพิ่มเติมโดยการเพิ่มความยืดหยุ่นของส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 โดยการแทนที่ , Proหรือ ด้วย glycine พบว่าโปรตีนกลายพันธุ์ทั้งสามชนิดนี้มีความเป็นพิษต่อลูกนํ้ายุงลดลง ซึ่งบ่งชี้ว่าความเสถียรของส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่เกิดจาก proline มีความสำคัญต่อความเป็นพิษของโปรตีน นอกจากนี้การจำลองการเคลื่อนไหวของโปรตีน Cry4Aa ในสารละลายแสดงให้เห็นว่า ยังมีบทบาทในการจัดเรียงโครงสร้างของโมเลกุลโปรตีนให้เหมาะสม ผลการทดลองทั้งหมดนี้แสดงให้เห็นว่าโครงสร้างที่เสถียรของส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 ที่ประกอบด้วย rich sequence มีบทบาทสำคัญในการแสดงความเป็นพิษต่อลูกนํ้ายุงของโปรตีน Cry4Aaxvi, 121 leaves : ill.application/pdfengBacillus thuringiensisEndotoxinsMahidol University