Validation and Stability Study as well as Quality Control of an Assay for Plasma Vitamin C Assessment Using High Performance Liquid Chromatography at Ramathibodi Hospital

Abstract

Background: L-ascorbic acid content in plasma is widely accepted as an indicator for vitamin C (VC) status. We set up a method using high performance liquid chromatography (HPLC) to improve the accuracy of plasma VC assessment at Ramathibodi Hospital. The objectives of this study were to validate the method and to determine the stability of VC in blood samples. Subjects and methods: Heparinized 225-mL plasma was extracted from healthy volunteers. The levels of VC were quantified using a HPLC system with UV detector at the wavelength of 245 nm. For stability analysis, aliquots of the extracts, which were preserved with 10% meta-phosphoric acid and stored at -70oC, were analyzed until the day 15th after collection. Results: Using our method. the percentage of accuracy was between 101.14 and 105.90%. Percentage of precision was 0.47%, on the same day, and 2.34 %, on a different day. Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 0.07 and 0.23 mg/mL, respectively. The linearity for VC concentrations, ranging from 1 - 40 mg/mL, had the correlation coefficient of 0.9997. The stability analysis in this study showed that VC levels remained stable at -70oC for 2 weeks. Conclusion: We demonstrated that our method provided the good accuracy and precision as well as acceptable LOD and LOQ for VC analysis with a small volume of plasma. Plasma kept for 2 weeks at -70oC could be analyzed for levels of VC. Therefore, this method is suitable for vitamin C assessment in patients, especially padiatric patiants, and researches

ความสำคัญ: กรดแอลแอสคอร์บิคในพลาสมาเป็นดัชนีชี้วัดภาวะวิตามินชีในมนุษย์ ช่วยประเมินและติดตามการรักษา ดังนั้น วิธีตรวจวิเคราะห์ที่ถูกต้องแม่นยำจึงสำคัญอย่างมากในทางคลินิกและงานวิจัย จุดประสงค์: เพื่อทดสอบความแม่นตรง และความเสถียรของวิธีวิเคราะห์ระดับวิตามินซีในพลาสมา โดยวิธีโครมาโทกราฟฟีของเหลวสมรรถนะสูง (High performance liquid chromatography, HPLC) ที่คณะแพทยศาสตร์โรงพยาบาลรามาธิบดี วิธีการวิจัย: พลาสมาปริมาณ 225 ไมโครลิตร จากอาสาสมัครสุขภาพดี ถูกนำมาผสมกับกรดเมตาฟอสฟอริคที่ความเข้มข้นร้อยละ 10 แล้วนำไปวัดระดับวิตามินชี ด้วยเครื่องชุด HPLC ที่ความยาวคลื่น 245 นาโนเมตร และประเมินความเสถียรของวิตามินซีในตัวอย่างพลาสมาซึ่งเก็บที่อุณหภูมิ -70oC ในวันที่ 1, 3, 7, 10 และ 15 หลังการเตรียมพลาสมา ผลการวิจัย: ความสัมพันธ์เชิงเส้นตรง (Linearity) ที่ความเข้มขัน 1 - 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร มีค่า correlation coefficient เท่ากับ 0.9997 ค่าความถูกต้อง (Accuracy) อยู่ระหว่างร้อยละ 101.14 และ 105.9 ค่าความแม่นยำ (Precision) เท่ากับร้อยละ 0.47 (ภายในวันเดียวกัน) แล 2.34 (ระหว่างวัน) ส่วนค่าขีดจำกัดการตรวจวัด (Limit of detection) และค่าขีดจำกัดการหาปริมาณ (Limit of quantification) เท่ากับ 0.07 และ 0.23 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลำดับ และระดับวิตามินในพลาสมาสามารถคงสภาพได้หลังจากเก็บตัวอย่างไว้นาน 15 วัน สรุป: วิธีวิเคราะห์นี้มีความถูกต้องและแม่นตามเกณฑ์มาตรฐาน ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างมีความสะดวก ไม่ยุ่งยากใช้เลือดปริมาณน้อย จึงเหมาะสมที่จะใช้ตรวจระดับวิตามินซีในพลาสมาของมนุษย์โดยเฉพาะเด็ก