Mutagenesis of Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase : lindages between anti-folate resistance and mutation at residue 108
Issued Date
2024
Copyright Date
1996
Resource Type
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xix, 86 leaves : ill. (some col.)
Access Rights
open access
Rights
ผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้า
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 1996
Suggested Citation
Suganya Yongkiettrakul Mutagenesis of Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase : lindages between anti-folate resistance and mutation at residue 108. Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 1996. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/100859
Title
Mutagenesis of Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase : lindages between anti-folate resistance and mutation at residue 108
Alternative Title(s)
ความสัมพันธ์ระหว่างการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 108 ในเอ็นไซม์ไดโฮโดรโฟแลต รีดักเทสของเชื้อ พลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่มและการดื้อยาแอนตี้โพเลต
Author(s)
Abstract
The roles of residue 108 of Plasmodium falciparum DHFR in conferring anti-folate resistance were investigated. Mutants containing mutations at residue 108 of synthetic plasmodial DHFR were constructed by combinatorial cassette mutagenesis, a process by which the target codon is mutated to encode for all possible amino acids. With the exception of S108K, all other DHFR mutants highly expressed DHFR as inactive inclusion bodies of molecular mass about 27 kDa in E. coli system. Active DHFR activity could be recovered upon refolding of the inclusion bodies. Substitution of Ser108 by other amino acids affected the kinetic parameters of the enzymes and altered the inhibitory effects against pyrimethamine and cycloguanil. Mutants with Thr or Asn at residue 108 caused approximately 50% reduction in DHFR activity as compared to the wild-type enzyme. Poor DHFR activities were observed from mutants with Gly, Ala, Gln at residue 108, and mutants with Cyc, Val, Leu and Met showed very poor DHFR activities. Mutations at residue 108 from Ser to lle, Arg, Pro, Asp, His, Tyr, Phe, Trp, Glu yielded inactive enzyme. The mutant DHFRs from S108G, S108C, S108A and S108Q were purified to homogeneity by methotrexate-sepharose affinity chromatography. The kinetic parameters and inhibition by antifolates of the mutant enzymes were investigated. Mutant DHFR with Ser108 to Gln mutation was highly resistant to both pyrimethamine and cycloguanil with elevated Km values for the substrates. However, other mutant DHFRs were susceptible to the drugs. Inhibition studies also revealed that the wild-type DHFR and DHFRs from S108N and S108Q mutants were competitively inhibited by pyrimethamine and cycloguanil. The data suggested that mutation at residue 108 from Ser to Asn was more preferably selected over other amino acids in nature, presumably due to its stability and ability to confer resistance to anti-folates, while substitutions with other amino acids might not be favorable or parasite survival.
จากหลักฐานข้อมูลการศึกษาที่ผ่านมา ได้บ่งชี้ ถึงความสัมพันธ์ระหว่างการดื้อยาแอนตี้โฟเลต และการ กลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 108 จากกรดอะมิโน serine เป็น asparagine ในเอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทส ของ เชื้อมาลาเรียพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม การศึกษานี้ต้องการ ที่จะเข้าใจความสำคัญของกรดอะมิโน serine ที่ตำแหน่ง 108 จึงได้นำเอายีนสังเคราะห์สำหรับเอ็นไซม์ไดไฮโดรเลต รีดักเทสของเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม มาเป็นแม่แบบใน การสร้างยีนกลายพันธุ์ โดยทำให้ตำแหน่งอะมิโนที่ 108 ซึ่งปรกติเป็น serine ถูกทดแทนด้วยกรดอะมิโนอื่นอีก 19 ชนิด จากผลการทดลองพบว่า ยีนกลายพันธุ์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทส เฉพาะสายพันธุ์ซึ่งมีกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 108 เป็น lysine เท่านั้นที่ไม่สามารถแสดงออก (expression) โปรตีนในเชื้อแบคทีเรียได้ ในขณะที่สายพันธุ์กลายซึ่งมีกรด อะมิโนอื่น ๆ อีก 19 ชนิด ที่ตำแหน่ง 108 สามารถแสดงออก โปรตีนในแบคทีเรียในรูปของ inclusion bodies ที่มีขนาด 27 กิโลดาลตัน เมื่อนำ inclusion bodies เหล่านี้มาทำให้ คืนสภาพโดยวิธีการ refolding ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม จะสามารถทำให้เอ็นไซม์กลับคืนสู่ภสพที่สามาระเร่งปฏิกริยา ได้ ผลการศึกษาได้พบว่า การกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 มีผลกระทบต่อคุณสมบัติทางจลศาสตร์ของเอ็นไซม์ และทำ ให้การยับยั้งการทำงานของเอ็นไซม์ด้วยสารแอนตี้โฟเลต เช่น ไพริเมธามีน และไซโคลกัวนิล เปลี่ยนแปลงไป กล่าวคือ เมื่อกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 108 ถูกแทนด้วย threonine และ asparagine จะทำให้การทำงานของเอ็นไซม์ลดลงถึง 50% เมื่อเทียบกับเอ็นไซม์สายพันธุ์แท้ (wild-type) ที่มี serine ที่ตำแหน่ง 108 ผลการทดลองยังได้พบอีกว่า ยีนสายพันธุ์ของ เอ็นไซม์ที่มีกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 เป็น glycine, alanine, glutamine, cysteine, valine, leucine และ methionine จะมีอัตราเร่งของเอ็นไซม์ที่ต่ำลงมาก ในขณะที่ยีนกลายพันธุ์ ของเอ็นไซม์มีกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 เป็น isoleusing, arginine, proline, aspartic acid, histidine, tyrosine, phenylalanine, tryptophan และ glutamine ไม่สามารถเร่งปฏิกริยาได้เลย จากการศึกษาคุณสมบัติทางจลศาสตร์ของเอ็นไซม์ บริสุทธิ์ที่แยกจากสายพันธุ์ 4 ชนิด ที่มีกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 เป็น glycine, cysteine, alanine และ glutamine ตลอดจนการยับยั้งเอ็นไซม์เหล่านี้ด้วยสารแอนตี้โฟเลต เช่น ไพริเมธามีน และไซโคลกัวนิล พบว่ายีนกลายพันธุ์ของ เอ็นไซม์ที่มีกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 เป็น glutamine ให้ เอ็นไซม์ที่ดื้อต่อสารแดนตี้โฟเลตทั้งสองชนิด และมีค่า K(,m) ต่อสัปสเตรทสูง ส่วนยีนกลายพันธุ์ของเอ็นไซม์ที่มีกรดอะมิโน glycine, cysteine และ alanine ที่ตำแหน่ง 108 นั้นไม่ดื้อต่อยาเลย เมื่อทำการศึกษาจลศาสตร์ของเอ็นไซม์ บริสุทธิ์ที่มีกรดอะมิโน asparagine และ glutamine ที่ตำแหน่ง 108 ได้พบว่า การยับยั้งการทำงานของเอ็นไซม์ ด้วยไพริเมธามีน และไซโคลกัวนิล มีลักษณะของการยับยั้ง เป็นแบบแข่งขัน (competitive inhibition) เช่นเดียว กับของเอ็นไซม์ wild-type จากข้อมูลการศึกษาสามารถ สรุปได้ว่า การกลายพันธุ์จากกรดอะมิโน serine เป็น asparagine ที่พบในเชื้อมาลาเรียที่ดื้อยาแอนตี้โฟเลตใน ธรรมชาตินั้น น่าจะเหมาะสมและเป็นประโยชน์แก่การอยู่ รอดของเชื้อมาลาเรีย ทั้งนี้เนื่องจากเอ็นไซม์กลายพันธุ์ ที่ได้นั้นมีเสถียรภาพ อีกทั้งมีความสามารถต้านทานต่อยา แอนตี้โฟเลตได้ ในขณะที่การกลายพันธุ์ไปเป็นกรดอะมิโน ชนิดอื่นนั้นไม่เหมาะสมที่จะเกิดขึ้นในธรรมชาติ
จากหลักฐานข้อมูลการศึกษาที่ผ่านมา ได้บ่งชี้ ถึงความสัมพันธ์ระหว่างการดื้อยาแอนตี้โฟเลต และการ กลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง 108 จากกรดอะมิโน serine เป็น asparagine ในเอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทส ของ เชื้อมาลาเรียพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม การศึกษานี้ต้องการ ที่จะเข้าใจความสำคัญของกรดอะมิโน serine ที่ตำแหน่ง 108 จึงได้นำเอายีนสังเคราะห์สำหรับเอ็นไซม์ไดไฮโดรเลต รีดักเทสของเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม มาเป็นแม่แบบใน การสร้างยีนกลายพันธุ์ โดยทำให้ตำแหน่งอะมิโนที่ 108 ซึ่งปรกติเป็น serine ถูกทดแทนด้วยกรดอะมิโนอื่นอีก 19 ชนิด จากผลการทดลองพบว่า ยีนกลายพันธุ์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทส เฉพาะสายพันธุ์ซึ่งมีกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 108 เป็น lysine เท่านั้นที่ไม่สามารถแสดงออก (expression) โปรตีนในเชื้อแบคทีเรียได้ ในขณะที่สายพันธุ์กลายซึ่งมีกรด อะมิโนอื่น ๆ อีก 19 ชนิด ที่ตำแหน่ง 108 สามารถแสดงออก โปรตีนในแบคทีเรียในรูปของ inclusion bodies ที่มีขนาด 27 กิโลดาลตัน เมื่อนำ inclusion bodies เหล่านี้มาทำให้ คืนสภาพโดยวิธีการ refolding ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม จะสามารถทำให้เอ็นไซม์กลับคืนสู่ภสพที่สามาระเร่งปฏิกริยา ได้ ผลการศึกษาได้พบว่า การกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 มีผลกระทบต่อคุณสมบัติทางจลศาสตร์ของเอ็นไซม์ และทำ ให้การยับยั้งการทำงานของเอ็นไซม์ด้วยสารแอนตี้โฟเลต เช่น ไพริเมธามีน และไซโคลกัวนิล เปลี่ยนแปลงไป กล่าวคือ เมื่อกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 108 ถูกแทนด้วย threonine และ asparagine จะทำให้การทำงานของเอ็นไซม์ลดลงถึง 50% เมื่อเทียบกับเอ็นไซม์สายพันธุ์แท้ (wild-type) ที่มี serine ที่ตำแหน่ง 108 ผลการทดลองยังได้พบอีกว่า ยีนสายพันธุ์ของ เอ็นไซม์ที่มีกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 เป็น glycine, alanine, glutamine, cysteine, valine, leucine และ methionine จะมีอัตราเร่งของเอ็นไซม์ที่ต่ำลงมาก ในขณะที่ยีนกลายพันธุ์ ของเอ็นไซม์มีกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 เป็น isoleusing, arginine, proline, aspartic acid, histidine, tyrosine, phenylalanine, tryptophan และ glutamine ไม่สามารถเร่งปฏิกริยาได้เลย จากการศึกษาคุณสมบัติทางจลศาสตร์ของเอ็นไซม์ บริสุทธิ์ที่แยกจากสายพันธุ์ 4 ชนิด ที่มีกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 เป็น glycine, cysteine, alanine และ glutamine ตลอดจนการยับยั้งเอ็นไซม์เหล่านี้ด้วยสารแอนตี้โฟเลต เช่น ไพริเมธามีน และไซโคลกัวนิล พบว่ายีนกลายพันธุ์ของ เอ็นไซม์ที่มีกรดอะมิโนตำแหน่ง 108 เป็น glutamine ให้ เอ็นไซม์ที่ดื้อต่อสารแดนตี้โฟเลตทั้งสองชนิด และมีค่า K(,m) ต่อสัปสเตรทสูง ส่วนยีนกลายพันธุ์ของเอ็นไซม์ที่มีกรดอะมิโน glycine, cysteine และ alanine ที่ตำแหน่ง 108 นั้นไม่ดื้อต่อยาเลย เมื่อทำการศึกษาจลศาสตร์ของเอ็นไซม์ บริสุทธิ์ที่มีกรดอะมิโน asparagine และ glutamine ที่ตำแหน่ง 108 ได้พบว่า การยับยั้งการทำงานของเอ็นไซม์ ด้วยไพริเมธามีน และไซโคลกัวนิล มีลักษณะของการยับยั้ง เป็นแบบแข่งขัน (competitive inhibition) เช่นเดียว กับของเอ็นไซม์ wild-type จากข้อมูลการศึกษาสามารถ สรุปได้ว่า การกลายพันธุ์จากกรดอะมิโน serine เป็น asparagine ที่พบในเชื้อมาลาเรียที่ดื้อยาแอนตี้โฟเลตใน ธรรมชาตินั้น น่าจะเหมาะสมและเป็นประโยชน์แก่การอยู่ รอดของเชื้อมาลาเรีย ทั้งนี้เนื่องจากเอ็นไซม์กลายพันธุ์ ที่ได้นั้นมีเสถียรภาพ อีกทั้งมีความสามารถต้านทานต่อยา แอนตี้โฟเลตได้ ในขณะที่การกลายพันธุ์ไปเป็นกรดอะมิโน ชนิดอื่นนั้นไม่เหมาะสมที่จะเกิดขึ้นในธรรมชาติ
Description
Biochemistry (Mahidol University 1996)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Biochemistry
Degree Grantor(s)
Mahidol University