Molecular cloning and expression of catalase gene of Lactobacillus sake 911 in Escherichia coli UM2

Abstract

The overall goal of this thesis project was to study and identify strain(s) of lactic acid bacteria that are commonly found in Thai fermented meat and vegetable products that have catalase activity. The catalase gene from a desired strain of lactic acid bacteria was selected, cloned and expressed in E. coli UM2. This genetic modification produced a strain of lactic acid bacteria which has a desired property of catalase activity and hence if use in food fermentation prevent rancidity and improve flavor of the fermented products. A total of 33 strains of lactobacilli isolated from Thai fermented meat and vegetable products were screened for catalase activity by oxygen bubble method and colorimetric determination of hydrogen peroxide method. Four strains of lactobacilli, Lactobacillus sake 911, Lactobacillus plantarum P30 - 1, Lactobacillus pentosus A27-2, and Lactobacillus species F3-2 were shown to have high catalase activity ranging from 50-80 (...)moles of hydrogen peroxide decomposed per minute per 3X10(8) colony forming units (CFU) as compared to catalase activity of the reference strain, Lactobacillus sake LTH677 in the presence of heme. The activity was pH independent in the range of 3.0-9.0. Catalase gene of Lactobacillus sake 911 was selected for cloning in E.coli UM2 by PCR method. The 1.4 kb fragment of catalase gene was obtained by using primers designed from the published catalase sequence of Lactobacillus sake LTH677. The Southern blot analysis confirmed the homology of this 1.4 kb fragment with catalase gene of Lactobacillus sake LTH677, before cloning into E.coli UM2 by using plasmid pMEx8 as expression vector. Transformants detected on LB ampicillin agar plates were found to produce oxygen bubbles when flooded with 0.87 M hydrogen peroxide solution. Catalase activities of 30 colonies of transformants harboring catalase gene were in the range of 1- 60 (...)moles of hydrogen peroxide decomposed per minute per 3X10(8) CFU Total soluble proteins analysis of transformed E.coli UM2 showed approximately 65-kDa protein which was the same size as the subunits of catalase found in Lactobacillus sake LTH677. The DNA sequencing of catalase gene of Lactobacillus sake 911 results in 1,451 bp containing cloning restriciton sites, Eco RI at 5 end and Kpn I at 3 end, and some deletions in 1,436 bp coding sequence. These deletions result in the gene that was stopped in the TGA sequence of the plasmid, which produced the extra 17 amino acid at 3 end of the gene. These DNA and amino acid sequences had 93.75% and 93.10% homology to the published sequence of Lactobacillus sake LTH677.

วัตถุประสงค์โดยทั่วไปของโครงการวิจัยคือ การศึกษาและจำแนกสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียที่มีความ สามารถในการสร้างกรดแลคติกในอาหารหมักดองของไทย ว่ามีความสามารถในการทำงานของเอนไซม์คะตะเลสมาก น้อยเพียงใด และทำการตัดต่อให้มีการแสดงออกของยีน คะตะเลสใน E. coli UM2 ซึ่งในอนาคตจะสามารถนำไป ปรับปรุงสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียที่มีความสามารถในการ สร้างกรดแลคติก แต่ไม่มีความสามารถในการทำงานของ เอนไซม์คะตะเลสได้ ซึ่งการทำงานของคะตะเลสเป็น คุณสมบัติที่จะนำไปใช้ป้องกันการเหม็นหืน และปรับปรุง รสชาติของผลิตภัณฑ์ของอาหารหมักดองของไทยต่อไป สายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียจำนวน 33 สายพันธุ์ ที่แยกได้จากอาหารหมักดองของไทยถูกนำมาศึกษาการทำงาน ของเอนไซม์คะตะเลส โดยวิธีการสังเกตดูฟองออกซิเจน ที่เกิดขึ้นจากการทำลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ของเอนไซม์ และวิธีการวัดสีที่เกิดขึ้นจากไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ เหลืออยู่ในปฏิกิริยา พบว่า 4 สายพันธุ์ อันได้แก่ Lactobacillus sake 911 Lactobacillus plantarum P30-1 Lactobacillus pentosus A27-2 และ Lactobacillus species F3-2 มีความสามารถในการ ทำงานของเอนไซม์ ในช่วง 50-80 ไมโครโมลของ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ถูกทำลายไปต่อนาที ต่อ 3 x 10(8) โคโลนี ในสภาวะที่มีฮีม และความสามารถนี้ ไม่แปรตามค่าความเป็นกรดด่างในช่วง pH 3.0-9.0 ยีนคะตะเลสของ Lactobacillus sake 911 ถูกเลือกเพื่อนำมาทำการตัดและต่อเข้า E. coli UM2 โดยที่ยีนคะตะเลสขนาด 1.4 กิโลเบส ของ Lactobacillus sake 911 ถูกนำมาเพิ่มจำนวนในหลอดทดลองด้วยเทคนิค พีซีอาร์ซึ่งใช้ Primers ที่ออกแบบจากยีนคะตะเลสของ Lactobacillu sake LTH677 วิธี Southern blot ถูกนำมาเพื่อใช้ดูความคล้ายกันของยีนคะตะเลสนี้ กับ ยีนคะตะเลสของ Lactobacillus sake LTH677 ก่อนที่จะ ทำการตัดและต่อเข้ากับดีเอ็นเอพาหะ pMEx8 E. coli UM2 ที่มียีนคะตะเลสนี้ สามารถผลิตฟองออกซิเจนหลังจากหยด ด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ความสามารถในการทำงานของ เอนไซม์จาก E. coli UM2 ที่มียีนคะตะเลสนี้อยู่ในช่วง 1-60 ไมโครโมลของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ที่ถูกทำลาย ไปต่อนาทีต่อ 3 x 10(8) โคโลนี การวิเคราะห์รูปแบบของ โปรตีน พบว่ามีโปรตีนขนาดประมาณ 65 กิโลดาลตัน ใน E. coli UM2 ที่มียีนคะตะเลสซึ่งเป็นขนาดเดียวกับขนาด ของหน่วยย่อยของเอนไซม์คะตะเลสที่พบใน Lactobacillus sake LTH677 จากผลของการหาลำดับเบสของยีนคะตะเลส ของ Lactobacillus sake 911 พบว่ามี 1,451 ลำดับเบส ที่ประกอบด้วยยีนโครงสร้างจำนวน 1,436 ลำดับเบส และ ตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ (Eco RI และ Kpn I) ซึ่งยีนโครงสร้างนี้มีความคล้ายกับยีนคะตะเลสของ Lactobacillus sake LTH677 ถึง 93.75% แต่เมื่อถอด รหัสของกรดอะมิโนพบว่า ยีน 1,436 ลำดับเบสนี้ ไม่หยุดตรง รหัสหยุดของยีน เนื่องจากมีลำดับเบสบางตัวหายไป ทำให้ การถอดรหัสไปหยุดตรงรหัสหยุดของดีเอ็นเอพาหะแทน ซึ่งทำ ให้มีจำนวนของกรดอะมิโนเกินมา 17 ตัว แต่อย่างไรก็ตาม ลำดับของกรดอะมิโนนี้ ยังมีความคล้ายกับลำดับอะมิโนของ เอนไซม์คะตะเลสถึง 93.10%