Study of hemolysin BL heterogeneity in bacillus cereus isolated in Thailand

Abstract

The presence of hemolysin BL (HBL; components L2, L1, and B) encoding genes (hblC, hblD and hblA) from 339 Bacillus cereus strains isolated in Thailand was determined. PCR analysis showed that all three hbl genes were detected in 222 strains (65.5%). Among those strains in which all three hbl genes were detected, 210 (61.9%) displayed a discontinuous hemolysis (DH) characteristic of HBL producers, while 12 (3.5%) showed a continuous hemolytic (CH) pattern on sheep blood agar. Interestingly, five strains where only hblC was detected showed a DH. The HpaII restriction profiles of 2.82 kp PCR fragments amplified from the hblC-A region in these five strains using hblC forward (FHC) and hblA reverse (RHA2) primers displayed five heterogeneous patterns, which indicated sequence variation. Western blot analysis using polyclonal antibodies (Pab) raised against HBL components purified from strain F837/76 showed that three of the five strains produced all three components whereas strain TG-00-06 did not show any signal for any components and TG-00-14 was negative for L2. By using Oxoid RPLA test which is specific to L2, three strains gave high titers (>64) whereas the strains TG- 00-06 and TG-00-14 showed lower titers of 16 and 32, respectively. The heterogeneity of hbl operons of those five strains was determined by sequencing of the PCR fragments. The deduced amino acid sequences of two lytic components (L1 and L2) showed 72-77% identity while binding components (B) showed 84% identity compared to those of reference strains. The comparisons of hbl operons in the five strains revealed the sequence variation at the primer binding sites such that the primers cannot anneal. A new set of PCR primers (FHC2-RHC2, FHD-RHD2, and FHA3-RHA3 for hblC, hblD and hblA, respectively) was developed from the conserved regions in hbl operons of seven B. cereus strains. The data show that HBL-encoding genes are prevalent among B. cereus isolated in Thailand and there is a high degree of heterogeneity in both the genes and proteins. Using new set of primers designed, all isolates which are positive by DH, Western blot analysis, or RPLA assay were all positive for three hbl genes by PCR. The results indicated the high specificity of these new set of primers for hbl genes of B. cereus.

ได้ศึกษาการมีอยู่ของยีนที่ผลิตสารพิษ hemolysin BL ในเชื้อ Bacillus cereus จำนวน 339 สายพันธุ์ที่แยกได้ในประเทศไทยโดยใช้วิธี PCR สารพิษดังกล่าวประกอบด้วยโปรตีน 3 ชนิด L2, L1, และ B ซึ่งสร้างจากยีน hblC, hblD และ hblA ตามลำดับ การศึกษาพบยีนทั้งสามในเชื้อจำนวน 222 สายพันธุ์ (65.5%) และพบว่าเชื้อสามารถย่อยเม็ดเลือดแดงของแกะในอาหารเลี้ยงเชื้อได้เป็นรูปแบบ discontinuous hemolysis (DH) ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของ hemolysin BL สิ่งที่น่าสนใจคือเชื้อ ห้าสายพันธุ์ที่แสดง DH มีเพียงยีน hblC เท่านั้นที่สามารถตรวจพบได้ อย่างไรก็ตาม การใช้คู่ primer FHC-RHA2 ให้ผลบวกโดยได้ PCR product ขนาด 2.82 kb และการตัดชิ้นยีนดังกล่าวด้วยเอนไซม์ ตัดจำเพาะ HpaII พบว่าได้ 5รูปแบบที่ได้มีความแตกต่างจากรูปแบบที่ได้จากสายพันธุ์อ้างอิง ได้ตรวจสอบ การผลิตโปรตีน B, L1, และ L2 โดยวิธี Western blot analysis พบว่า เชื้อสามสายพันธุ์ (SS-00- 15, F-00-25 และ NR-01-49) ผลิตโปรตีนทั้งสามชนิด ที่สามารถทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีต่อโปรตีนที่ ผลิตจากเชื้อสายพันธุ์ F837/76 ในขณะที่หนึ่งสายพันธุ์ (TG-00-06) ให้ผลลบกับแอนติบอดีทั้งสาม ชนิด และหนึ่งสายพันธุ์ (TG-00-14) ให้ผลลบเฉพาะกับโปรตีน L2 การตรวจหาโปรตีน L2 ยังได้ทำโดย ใช้ชุดตรวจสอบ RPLA kit พบว่าเชื้อที่ให้ผลบวกต่อแอนติบอดีทั้งสามชนิดได้ให้ผลบวกที่ titer > 64 ต่อการทดสอบ ในขณะที่เชื้อสายพันธุ์ TG-00-06 และ TG-00-14 ให้ผลบวกที่ titer 16 และ 32 ซึ่ง เป็นผลบวกในระดับต่ำ จากการเปรียบเทียบกรดอะมิโนที่ได้จากการอ่านลำดับเบส พบว่าโปรตีน L ทั้งสอง ชนิดมีส่วนเหมือนกับโปรตีน L ของสายพันธุ์อ้างอิงประมาณ 72-77% ในขณะที่โปรตีน B มีความเหมือน ประมาณ 84% การเปรียบเทียบลำดับเบสของยีน hbl ทั้งสามยีนที่ได้จากเชื้อทั้งห้าสายพันธุ์กับยีนของสาย พันธุ์อ้างอิงสองสายพันธุ์ พบว่าบริเวณที่จับกับ primer ในยีนของสายพันธุ์ทั้งห้ามีความแตกต่างจากในสาย พันธุ์อ้างอิง เป็นผลให้ได้ผลลบในการทำ PCR กับทั้งห้าสายพันธุ์ จึงได้ออกแบบ primer ชุดใหม่ขึ้น (FHC2-RHC2, FHD-RHD2, และ FHA3-RHA3 สำหรับตรวจหา hblC, hblD and hblA ตามลำดับ) โดยเลือกจากลำดับเบสที่ conserved ในทั้งเจ็ดสายพันธุ์ และพบว่าให้ผลบวกอย่างจำเพาะ เจาะจงกับทั้งสามยีนในการทำ PCR ในเชื้อที่ให้ผลบวกกับ DH Western blot หรือ RPLA อย่างใด อย่างหนึ่ง