Molecular cloning of glucoamylase gene from cephalosporium eichhorniae

Abstract

The Cephalosporium eichhorniae glucoamylase-encoding gene (3.1 kb EcoRI fragment) was isolated from ʎgt10 genomic library using non radioisotope labelled (enhanced chemiluminescence; ECL) synthetic oligonucleotide oliBT2 as a probe. The sequence of the probe was derived from Aspergillus niger glucoamylase gene. The efficiency of in vitro packaging was 10(6) pfu/µg. From 2x10(5) ʎ plaques being screened, 8 positive plaques were obtained. The length of these inserts was in the range of 3-5 kb. The positive clones were further probed with oli l17 and oli ll8 whose sequences were taken from 5 upstream and 3 downstream regions of the A. niger glucoamylase gene. The insert of 3.1 kb which gave strong signal from Southern blot analysis was further subcloned into pBluescript II KS+. The restriction map revealed that this 3.1 kb EcoRI fragment contained several unique restriction enzyme sites including Bg/II, Hind III, KpnI, NdeI, PstI, two EcoRV, and six Sau3AI sites.

ยีนกลูโคอะไมเลสขนาด 3.1 kb ที่มีปลาย EcoRl ถูกคัดแยกออกมาจาก library ของเชื้อ Cephalosporium eichhorniae ที่สร้างขึ้นโดยใช้ ʎgt10 เป็นดีเอ็นเอ พาหะและใช้ดีเอ็นเอติดตาม (oliBT2) ที่ติดฉลากด้วยสาร ปลอดรังสี (ECL-enhance chemiluminescence) ลำดับเบส ของ oliBT2 ถูกดัดแปลงมาจากลำดับเบสของยีนกลูโคอะไมเลส ของเชื้อ Aspergillus niger ประสิทธิภาพของการ in vitro packaging คือ 10(6) pfu/µg จากจำนวน 2x10(5) ʎ plaques ที่ทำการตรวจ พบว่ามี 8 plaques ที่มียีน กลูโคอะไมเลสอยู่ ซึ่งมีขนาดชิ้นส่วนของดีเอ็นเออยู่ใน ช่วง 3-5 kb หนึ่งในจำนวนทั้งหมด 8 โคลน (3-1) มียีน กลูโคอะไมเลสครบทั้งยีน โดยการติดตามด้วยตัวติดตามอีก 2 ตัวคือ oli117 และ oli118 จากนั้นชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ ที่มีขนาด 3.1 kb จากโคลน 3-1 ซึ่งให้ signal ที่เข้มจาก Southern blot analysis ถูก subclone ในพลาสมิด pBluescript ll KS(+) จากการตัดย่อยด้วยเอนไซม์ตัด จำเพาะพบว่า มี 1 ตำแหน่งที่ตัดด้วย Bg/ll, Hindlll, Kpnl, Ndel, Pstl, 2 ตำแหน่งที่ตัดด้วย EcoRV และ 6 ตำแหน่งที่ตัดด้วย Sau3Al