Functional characterization of charged residues in the B10-B11 receptor-binding loop of Bacillus thuringiensis Cry4Aa and Cry4Ba Toxins

Abstract

Cry4Aa and Cry4Ba, two closely related mosquito-active toxins produced by Bacillus thuringiensis subsp. israelensis during sporulation, are highly specific to different target mosquito-larvae, according to high dissimilarity between their receptor-binding domain (II). Single-alanine substitutions of five amino-acid residues within the β10-β11 loop of Cry4Aa-domain II revealed that only Lys514 is required for Cry4Aa toxicity against Culex larvae. Opposite to that of Cry4Aa, the β10-β11 loop of Cry4Ba which is less toxic to Culex larvae contains a negative residue-Asp454. Target specificity analysis via charge reversal mutagenesis of the Cry4Ba-Asp454 revealed that D454K and D454R substitutions can introduce Culex toxicity to the Cry4Ba toxin, although D454A mutation showed no effect on toxicity against Culex larvae. Consistent with data from bioassays, in situ binding analysis via immunohistochemical assay displayed that both D454K and D454R mutants, but not the D454A mutant, showed a significant increase in binding to Culex-larval gut membrane. These data suggest that charge within the β10-β11 loop is a determinant for different Culex toxicity between Cry4Ba and Cry4Aa toxins, thus suggesting that both toxins bind to Culex receptor through ionic interactions.

โปรตีนสารพิษฆ่าลูกน้ำยุง ชนิด Cry4Aa และ Cry4Ba จากแบคทีเรียชนิด Bacillus thuringiensis มีความจำเพาะต่อลูกน้ำยุงที่แตกต่างกัน อันเป็นผลมาจากความแตกต่างทาง โครงสร้างในส่วนบริเวณที่ 2 (Receptor-binding domain) ของโปรตีนสารพิษทั้งสองชนิดนี้ การศึกษาด้วยการแทนที่กรดอะมิโนในส่วนเชื่อมต่อเบต้าที่ 10 และ 11 ในบริเวณส่วนที่ 2 ของ โปรตีน Cry4Aa ด้วย alanine พบว่าเฉพาะโปรตีนกลายพันธุ์ชนิด K514A ที่สูญเสียความเป็น ขั้วบวกเท่านั้นที่ออกฤทธิ์ฆ่าลูกน้ำยุง Culex quinquefasciatus ลดลง เป็นที่น่าสังเกตว่าในทาง ตรงกันข้าม โปรตีน Cry4Ba ซึ่งมีความเป็นพิษน้อยต่อลูกน้ำยุง C. quinquefasciatus นั้นมีกรดอะมิ โนที่มีความเป็นขั้วลบ (Asp454) ในส่วนเชื่อมต่อเบต้า 10 และ 11 และจากการศึกษาเพิ่มเติมพบว่า โปรตีนกลายพันธุ์ D454R และ D454K ของโปรตีน Cry4Ba มีความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุง C. quinquefasciatus เพิ่มขึ้นอย่างชัดเจนเมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนกลายพันธุ์ D454A นอกจากนี้ผล จากการทดลองด้วยวิธี immune-histochemistry แสดงให้เห็นว่า เฉพาะโปรตีนกลายพันธ์ชนิด D454R และ D454K เท่านั้นที่สามารถจับกับส่วนบนสุดของเซลล์บุผิวของกระเพาะลูกน้ำยุง C. quinquefasciatus ได้ในปริมาณที่เพิ่มขึ้นกว่าเดิม จากผลทดลองในครั้งนี้จึงได้เสนอว่าชนิดของ ความเป็นขั้วที่ตรงกันข้ามของส่วนเชื่อมต่อเบต้า ที่10 และ 11 ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงทั้ง 2 ชนิดนี้ มีผลต่อความจำเพาะในการฆ่าลูกน้ำยุงชนิด C. quinquefasciatus