Separation of amino acids by capillary electrophoresis

Abstract

Amino acids are the building blocks of proteins, and the determination of the amino acids composition of proteins is therefore of considerable interest. This work described the determination of seventeen essential amino acids using precolumn derivatization method. The derivatization reagent is 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC). Two separation techniques were employed, capillary electrophoresis (CE) and high-performance liquid chromatography (HPLC). CE permited AQC derivatives of amino acids to be detected at 254 nm with micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) mode. Fifteen AQC-amino acids could be separated within 70 minutes using a buffer solution of 25 mM SDS in 40 mM borate (pH 10.00) and a 75 (...)m i.d.x57 cm fused silica capillary. The effect on the migration behavior with voltage and pH were investigated. Aminoadipic acid was used as an internal standard. With reversed-phase high-performance liquid chromatography, the complete separation of seventeen AQC-amino acids was achieved on a C-18 column using an acetate-phosphate buffer as mobile phase A and acetonitrile/water (60:40,v/v) as mobile phase B in combination with UV and fluorescence detection. The gradient elution gave a shorter separation time of 40 minutes, as compared with MECC. Reproducibility and precision obtained from the optimised HPLC, with external standard method, were acceptable. Two techniques were applied to the analysis of intravenous amino acid solution. The results of the analysis using MECC agreed with those obtained by HPLC and also with the label information.

การวิเคราะห์ชนิดและปริมาณของกรดอะมิโนได้รับ ความสนใจอย่างมาก เนื่องจากกรดอะมิโนเป็นองค์ประกอบ พื้นฐานของโปรตีน ในงานวิจัยนี้ได้ศึกษาวิธีวิเคราะห์ กรดอะมิโน 17 ชนิด ซึ่งพบมากในธรรมชาติโดยเตรียมให้อยู่ ในสภาพสารอนุพันธ์ด้วยรีเอเจนต์ 6-aminoquinolyl-N- hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) เพื่อเพิ่ม ประสิทธิภาพในการตรวจวัดสัญญาณ แล้วจึงนำไปวิเคราะห์ด้วย เครื่องมือ พบว่ากรดอะมิโน 15 ชนิดจาก 17 ชนิดสามารถแยก ได้ภายใน 70 นาทีโดยเทคนิค Capillary Electrophoresis (CE) แบบ Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) ด้วยสารละลายอิเล็กโทรไลต์ผสม ของโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) ความเข้มข้น 25 มิลลิโมลาร์ และโซเดียมบอเรต 40 มิลลิโมลาร์ pH 10.00 ในท่อแก้วขนาด เล็ก (capillary) ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 75 ไมโครเมตร และความยาว 57 เซนติเมตร แล้ววัดการดูดกลืนแสงที่ความยาว คลื่น 254 นาโนเมตร ได้ศึกษาตัวแปรที่มีผลต่อการแยกคือ ความต่างศักย์ และ pH ของสารละลายอิเล็กโทรไลต์ และพบว่า การใช้ internal standard ทำให้ผลการวิเคราะห์โดย MECC มีความเที่ยงมากขึ้น ส่วนเทคนิคไฮเปอร์ฟอร์มานซ์ลิควิด- โครมาโทกราฟฟีกระทำโดยการเปลี่ยนแปลงส่วนประกอบของ วัฎภาคเคลื่อนที่สองชนิดคือสารละลายบัพเฟอร์อะซีเตท-ฟอสเฟท และสารละลายผสมอะซีโทรไนไตรล์และน้ำ (อัตราส่วน 60:40 โดยปริมาตร) โดยอาศัยเครื่องตรวจวัด 2 ชนิดคือ ยูวี- สเปกโทรโฟโตเมตรี และสเปกโทรฟลูออโรเมตรี พบว่าสามารถ ให้การแยกที่สมบูรณ์ของสารอนุพันธ์ของกรดอะมิโนทั้ง 17 ชนิด ภายใน 40 นาที ซึ่งเร็วกว่าวิธี CE แบบ MECC การวิเคราะห์ปริมาณโดยเทคนิคไฮเปอร์ฟอร์มานซ์ลิควิด- โครมาโทกราฟฟีโดยใช้วิธี external standard พบว่าให้ค่า ความเที่ยงที่ยอมรับได้ ทั้งสองเทคนิคที่ศึกษาได้ประยุกต์ ใช้ในการวิเคราะห์กรดอะมิโนในเชิงคุณภาพและปริมาณ ในตัวอย่างสารละลายอะมิโนที่ฉีดให้คนไข้ทางหลอดเลือดดำ เพื่อเปรียบเทียบผลการวิเคราะห์กับความเข้มข้นของกรด อะมิโนที่แจ้งบนฉลากตัวอย่าง