Genetically engineering an active hybrid mosquito-larvicidal toxin

Abstract

During sporulation, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) and Bacillus sphaericus (Bs) produce toxin inclusions which are specifically toxic to mosquito larvae. Whilst Bs toxins are toxic mainly to Culex larvae, Bti inclusions containing four major toxins, CryIVA, CryIVB, CryIVD and CytA, are much more active against Aedes species. An attempt was made to construct an active hybrid toxin with a broader range of toxicity. By using Vent DNA polymerase in a PCR based reaction known as SOE (gene splicing by overlap extension), fusion genes were obtained in which the truncated cryIVB gene segment was attached to either of the Bs toxin genes. These fusion gene fragments of 3.7 and 3.3 kb were subsequently cloned into the pMEx8 vector yielding recombinant plasmids designated as plVB-7051 and pIVB-7042. When these recombinant plasmids were expressed in E. coli under the regulation of tac promoter, fusion proteins were apparently produced as sedimentable inclusions. Western blot analysis revealed that the sedimented protein fractions from E. coli clone IVB-7042 contained a major immunoreactive band of 110 kDa, but no hybrid product was observed in those prepared from clone IVB-7051. In toxicity assays, E. coli cells harbouring pIVB-7042 was toxic to Aedes aegypti larvae but had no effect to Culex quinquefasciatus larvae. However, E. coli cells containing pIVB-7051 showed no mosquito-larvicidal activity against either of the larvae.

Bacillus thuringiensis สายพันธุ์ israelensis (Bti) และ Bacillus sphaericus (Bs) เป็นแบคทีเรีย ที่ผลิตสารพิษในรูปของผลึกโปรตีนในระหว่างการสร้างสปอร์ ซึ่งมีฤทธิ์ฆ่าลูกน้ำยุงได้อย่างจำเพาะเจาะจง โดยโปรตีน สารพิษของ Bs มีความจำเพาะต่อลูกน้ำยุงสายพันธุ์ Culex มากที่สุด ในขณะที่ผลึกโปรตีนสารพิษจาก Bti ประกอบด้วย โปรตีน CryIVA, CryIVB, CryIVD และ CytA ที่ออกฤทธิ์ ต่อลูกน้ำยุงสายพันธุ์ Aedes ได้ดีกว่า ดังนั้นการสร้าง โปรตีนสารพิษลูกผสม จึงเป็นทางเลือกหนึ่งที่สามารถเพิ่ม ประสิทธิภาพในการฆ่าลูกน้ำยุงได้หลายสายพันธุ์ การศึกษาวิจัยครั้งนี้ได้เชื่อมส่วนของยีนที่ควบคุม การสร้างโปรตีนสารพิษของ cryIVB-Bti เข้ากับยีนที่ควบคุม การสร้างโปรตีนสารพิษขนาด 51 และหรือ 42 กิโลดาลตัน ของ Bs โดยใช้เทคนิค SOE ซึ่งอาศัยหลักการทาง PCR ร่วม กับการใช้เอนไซม์ Vent DNA polymerase และได้ผลิตผล ตามต้องการ คือ 3.7 และ 3.3 กิโลเบส จากนั้นได้นำมา เชื่อมต่อเข้ากับพลาสมิดพาหะ(pMEx8) และใช้ชื่อพลาสมิด ลูกผสมว่า pIVB-7051 และ pIVB-7042 โดยพบว่าพลาสมิด ลูกผสมทั้ง pIVB-7042 และ pIVB-7051 สามารถแสดงออกได้ ใน E. coli ภายใต้การควบคุมของ tac promoter และให้ ผลิตผลในรูปของผลึกโปรตีน จากการตรวจสอบ Western blot พบว่าผลึกโปรตีนสารพิษจากพลาสมิดลูกผสม pIVB-7042 สามารถ ทำปฏิกิริยาอย่างจำเพาะกับแอนติบอดี้และได้รับแถบโปรตีน ขนาด 110 กิโลดาลตัน ในขณะที่พลาสมิดลูกผสม pIVB-7051 ไม่ให้ผลิตผลตามต้องการ จากการตรวจสอบคุณสมบัติในการฆ่า ลูกน้ำยุงพบว่า พลาสมิดลูกผสม pIVB-7042 ที่แสดงออกใน E. coli สามารถฆ่าลูกน้ำยุงเฉพาะสายพันธุ์ Aedes aegypti ได้ แต่ไม่สามารถฆ่าลูกน้ำยุงสายพันธุ์ Culex quinquefasciatus ในขณะที่พลาสมิดลูกผสม pIVB-7051 ที่แสดงออกใน E. coli ไม่สามารถออกฤทธิ์ฆ่าลูกน้ำยุงทั้งสองสายพันธุ์ดังกล่าวได้