Sulfonamide resistance in Mycobacterium leprae

Abstract

The dihydropteroate synthase is one of several crucial enzymes in the de novo biosynthesis of folate cofactors. Since this enzyme is found only in microorganisms and is absent in the human cell, it is an ideal target for enzyme inhibitor development. It has long been known that sulfa drugs act by targeting this enzyme, and that resistance to sulfa drugs in many microorganisms has been associated with mutations in the gene coding for this enzyme. Mutations at residues 53 and 55 of M.leprae have previously been reported from dapsone-resistant strains, however, there is no definite evidence linking these mutations with the resistant phenotype in M.leprae. I cloned the wild-type M.leprae folP gene and three mutants - two single mutants (T53I, P55R) and one double mutant (T53I+P55R) - inserted them into an expression vector, and expressed them in the dihydropteroate synthase-deficient E.coli strain, All recombinant plasmids encoding for dihydropteroate synthase produced functional enzymes that could complement the growth on the minimum media by E.coli lacking the gene encoding for this enzyme. Sulfonamide drugs at the concentration that inhibited the growth of the wild-type clone of dihydropteroate synthase did not inhibit the growth of mutant clones, indicating that the mutations at residues 53 and 55 - corresponding to mutants T531 and P55R - in the gene coding for the enzyme contributed to drug resistance in M.leprae. Prior to kinetic analysis, the enzymes were purified to homogeneity by means of a short nucleotide sequence encoding six histidine residues that had earlier been introduced at the 3' end of the folP gene. For the mutant enzymes, as compared to the wild type, analysis showed an 8- to 50-fold increase in Km to the enzyme substrate (para-aminobenzoic acid) and a 20- to 1,000-fold increase in Ki to and IC50 of para-aminobenzoic analogues (enzyme inhibitors). The results suggest that residues 53 and 55 of dihydropteroate synthase in M.leprae are crucial for catalysis, since mutations at these two residues affect the affinity for binding both to the enzyme substrate and to enzyme inhibitors (sulfonamide compounds).

ไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทส เป็นเอ็นไซม์หนึ่งที่สำคัญต่อขบวนการสังเคราะห์โฟเลทภายในสิ่งมีชีวิต เนื่องจากเอนไซม์นี้พบเฉพาะในเชื้อจุลชีพและไม่พบในมนุษย์ ดังนั้นเอ็นไซม์นี้จึงเป็นเป้าสำคัญต่อการพัฒนายาซัลฟา การดื้อยาซัลฟาในเชื้อจุลชีพหลายชนิดเป็นผลมาจากการเปลี่ยนแปลงของยีนสังเคราะห์เอ็นไซม์ไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทส ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าพบการเปลี่ยนแปลงเกิดขึ้นที่ตำแหน่ง 53 และ 55 ในเอ็นไซม์ไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทสที่สกัดได้จากเชื้อโรคเรื่อนที่ดื้อต่อยาซัลฟา แต่ยังไม่มีหลักฐานที่แน่ชัดว่าการเปลี่ยนแปลงดังกล่าวส่งผลให้เกิดการดื้อยาซัลฟาในเชื้อโรคเรื้อน ผู้วิจัยทำการโคลนยีนปรกติ ยืนผิดปรกติหนึ่งตำแหน่ง (T53I, P55R) และยีนผิดปรกติสองตำแหน่ง (T53I+P55R) เข้าตัวนำพาหะและทำการแสดงออกใน E.coli ที่ขาดเอ็นไซม์ไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทสเพื่อความสะดวกในการแยกโปรตีนบริสุทธิ์ นิวคลีโอไทด์ชิ้นเล็กที่สังเคราะห์ฮีสทิดีน 6 ตัวถูกนำไปต่อไว้ด้าน 3' ของยีนไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทส (folP) ตัวนำพาหะของไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทสทั้งหมดสามารถสังเคราะห์เอนไซม์ไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทสที่มีความสมบูรณ์ในการเร่งปฏิกริยา โดยสามารถส่งเสริมการเติบโตของ E.coli ที่ขาดเอ็นไซม์นี้บนอาหารเลี้ยงเชื้อไม่สมบูรณ์ได้ ความเข้มข้นของยาซัลโฟนาไมด์ที่สามารถยับยั้งการเติบโตของโคลนปรกติแต่ไม่สามารถยับยั้งการเติบโตของโคลนผิดปรกติ แสดงให้เห็นว่าความผิดปรกติ T531 และ P55R ทำให้เชื้อวัณโรคเกิดการดื้อยาซัลฟา ผลการศึกษาเอ็นไซม์ไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทสบริสุทธิ์ พบว่าเอ็นไซม์ผิดปรกติมีค่า Km ต่อ pABA สูงขึ้น 8-50 เท่า ค่า K1 และ IC50 ต่อยาซัลฟาสูงขึ้น 20-1,000 เท่า แสดงให้เห็นว่าตำแหน่งที่ 53 และ 55 ในไดไฮดรอพเทอโรเอท ซินเทสของเชื้อโรคเรื้อนมีความสำคัญต่อการเกิดปฏิกริยา โดยความผิดปรกติทั้งสองตำแหน่งมีผลต่อสามารถของเอ็นไซม์ในการจับ pABA และ ยาซัลโฟนาไมด์