Characterization and expression analysis of a xanthomonas oryzea pv. oryzae racA operon

Abstract

A plasmid pSM-Al containing the recA gene isolated from Xoo library by complementation of DNA repair defects of Escherichia coli recA mutants has been further characterized. DNA sequencing of the 2.2 kb inserted fragment of pSM-AI revealed a rec operon that contained two bicistronic genes, recA and recX The recX was located downstream of the recA gene. From Northern blot analysis, it was found that both recA and recX were cotranscribed and produced 1.8 kb transcripts. The genes were also coregulated and were induced by H2O2, MMS but not by paraquat treatments. From Western blot analysis using anti E. coli RecA antibody showed that RecA was induced by mutagens and peroxide treatments but not by heat shock or superoxide generators. In Xoo, recA transcription regulation was not under growth phase regulation or starvation response. An insertion inactivation of the recA gene was performed and a resultant recA mutant showed increased sensitivity to peroxides, mutagens killings. The mutant was also defected in cell division. The increase sensitivity to H2O2 killing was observed at low cell density while at high cell density there was little difference in sensitivity between a wild type and a recA mutant. The H2O2 induction of recA resulted from hydroxyl radicals production via the Fenton reaction and can be blocked by an hydroxyl radicals absorber. The mutation in the recX gene did not show increase sensitivity toward stresses nor it showed any effects on cell division.

พลาสมิด pSM-A1 ที่มียีส recA ซึ่งถูกทำการแยกจาก ห้องสมุด DNA ของเชื้อ Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) โดยวิธีการ complement การซ่อมแซม DNA ของเชื้อ E. coli recA ได้ถูกนำมาศึกษาต่อในวิทยานิพนธ์นี้ โดยเริ่ม จากการหาลำดับเบสของชิ้นส่วน DNA ขนาด 2.2 kb ภายใน พลาสมิด pSM-A1 ทำให้พบ rec operon ซึ่งประกอบด้วยยีน สองยีนคือ recA และยีน recX อยู่ด้วยกัน โดยที่ยีน recX จะมีลำดับต่อจากยีน recA จากการศึกษาโดยวิธี Northern blot พบว่า ยีนทั้งสองนี้ถูกควบคุมและถูก transcribe มา ด้วยกันทำให้ได้ mRNA ขนาด 1.8 kb และถูกเหนี่ยวนำได้ด้วย สาร H2O2, MMS แต่จะไม่ถูกเหนี่ยวนำด้วย paraquat นอกจากนี้การศึกษาโดยวิธี Western blot ที่ใช้แอนติบอดีต่อ โปรตีน RecA ของเชื้อ Escherichia coli เป็นตัวตรวจสอบ แสดงให้เห็นได้ว่า การสร้างโปรตีน RecA จะถูกเหนี่ยวนำด้วย perosicde และ mutagen ต่างๆ แต่สารที่สร้าง superoxide เช่น paraquat กับอุณหภูมิที่เปลี่ยนไปจะไม่มีผลต่อการสร้าง โปรตีนนี้ และการควบคุมยีน recA ยังไม่ขึ้นกับสภาวะการขาด อาหารหรือตัวควบคุมที่เกี่ยวข้องกับระยะการเจริญเติบโตของ เซลล์ เมื่อเชื้อ Xoo ถูกทำลายยีน recA โดยวิธี insertion inactivation พบว่ามีการเพิ่ม sensitivity ต่อสาร mutagen และสาร peroxide และยังมีความผิดปกติเกี่ยวกับ การแบ่งเซลล์อีกด้วย ถ้ามีการเติมสาร H2O2 ในสภาวะ ที่มีจำนวนเซลล์น้อยจะพบว่าเซลล์ที่ถูกทำลายยีน recA มี sensitivity เพิ่มมากขึ้น แต่ในสภาวะที่มีจำนวนเซลล์หนาแน่น กลับพบว่า sensitivity ต่อ H2O2 ของเซลล์ปกติกับ เซลล์ที่ยีน recA ถูกทำลายนั้นไม่ต่างกัน นอกจากนี้ยังพบว่า การเหนี่ยวนำยีน recA โดยการเติมสาร H2O2 นี้ เนื่องมาจากการสร้าง hydroxyl radicals โดยปฏิกิริยา Fenton ดังนั้นเมื่อเติมสารที่จับ hydroxyl radicals เช่น glycerol การเหนี่ยวนำนี้จะถูกยับยั้งไว้ จากการศึกษาเชื้อที่ ยีน recX ถูกทำลายไม่พบว่าเชื้อนี้มีความผิดปกติเกี่ยวกับการ แบ่งเซลล์ หรือมี sensitivity ต่อ stress ต่างๆ แตกต่าง ไปจากเซลล์ปกติ