Development of double-stranded RNA-delivery system for control of Laem-Singh virus (LSNV) in Thai penaeus monodon

Abstract

RNA interference (RNAi) technology through the trigger of double-stranded RNA (dsRNA) has been applied to inhibit viral replication in penaeid shrimp. In this study, we have developed a new methodology to deliver dsRNA for controlling Laem-Singh virus (LSNV), a causative agent of Monodon Slow Growth Syndrome in Penaeus monodon (P. monodon). First, the transformed Escherichia coli (E. coli) expressing red fluorescent protein (RFP) was tested in the Artemia enrichment process. RFP signals detectable in the gut of Artemia under confocal microscope were evident for the successful encapsulation. Second, the Artemia enrichment process was performed using E. coli producing LSNV-specific dsRNA. By reverse transcription-PCR (RT-PCR), dsRNA-LSNV was detected in Artemia after enriching with 4.3 x 1011 CFU of E. coli expressing dsRNA-LSNV for 2 hours. Artemia containing dsRNA-LSNV were subjected to the feeding test with P. monodon postlarvae 1-15. According to RT-PCR analysis, 38% and 74% LSNV-infected shrimp were observed in the dsRNA-treated and control groups, respectively. Quantitative RT-PCR indicated that a number of LSNV copies in most of the treated shrimp were, at least, 1000-fold lower than the untreated controls. During 11-17 weeks after feeding, the average body weight of the treated group was markedly increased relative to the control group. These results suggest that feeding shrimp with the dsRNA-enriched Artemia can eliminate LSNV infection, which is the cause of retarded growth in P. monodon. An additional investigation on feed formulated with dsRNA-LSNV suggests the potential of this method for delivering dsRNA to juvenile shrimp. In conclusion, therapeutic dsRNA can be delivered to post larval and juvenile shrimp via Artemia enrichment and feed formulation, respectively.

กระบวนการ RNA interference (RNAi) ซึ่งอาศัยการทำงานของอาร์เอ็นเอสายคู่ ได้มีการประยุกต์ใช้ เพื่อป้องกันการเพิ่มจำนวนของไวรัสในกุ้งอย่างกว้างขวาง โดยงานวิจัยนี้ได้ทำการพัฒนาระบบการส่งผ่านอาร์เอ็นเอ สายคู่ขึ้น เพื่อป้องกันไวรัสแหลมสิงห์ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคโตช้าในกุ้งกุลาดำ เริ่มต้นจากการทดสอบการส่งผ่าน แบคทีเรียที่สามารถผลิตสาร red fluorescent protein (RFP) เข้าสู่อาร์ทีเมีย โดยพบสัญญาณสีแดงของสาร RFP ภายในลไส้ของอาร์ทีเมียเมื่อส่องใต้กล้อง confocal ซึ่งแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงความสเร็จในการนำส่งสารโดย ใช้อาร์ทีเมียเป็นตัวกลาง ในส่วนที่สองคือการใช้อาร์ทีเมียเป็นตัวกลางในการส่งผ่านอาร์เอ็นเอเข้าสู่กุ้ง จากวิธี reverse-transcription PCR (RT-PCR) พบสารอาร์เอ็นเอสายคู่ ภายในอาร์ทีเมียที่ได้รับอาร์เอ็นเอสายคู่จากแบคทีเรีย ปริมาณ 4.3 x 1011 CFU เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เพื่อทดสอบประสิทธิภาพในการต้านทานไวรัสแหลมสิงห์ในกุ้ง ได้ทำ การให้อาร์ทีเมียที่มีอาร์เอ็นเอสายคู่แก่กุ้งในระยะ postlarvae (PL) 1 ถึง PL15 ผลการทำ RT-PCR พบไวรัสในกุ้งร้อย ละ 38% และ 74% ในกุ้งกลุ่มที่ได้รับและไม่ได้รับอาร์เอ็นเอสายคู่ตามลำ ดับ และเมื่อวิเคราะห์หาปริมาณไวรัสด้วย วิธี real-time RT-PCR พบว่ากุ้งที่ได้รับอาร์เอ็นเอสายคู่มีปริมาณไวรัสที่น้อยกว่ากลุ่มที่ไม่ได้รับถึง 1000 เท่า สำหรับน้ำ หนักกุ้งพบว่าสัปดาห์ที่ 11-17 หลังจากได้รับอาร์ทีเมีย กุ้งที่ได้รับอาร์เอ็นเอสายคู่มีน้ำ หนักเฉลี่ยมากกว่ากลุ่มที่ ไม่ได้รับ จากการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่าการส่งผ่านอาร์เอ็นเอสายคู่โดยผ่านอาร์ทีเมียให้ผลในการกำจัดไวรัส แหลมสิงห์ได้ อย่างมีประสิทธิภาพ นอกจากนี้การใช้อาหารเม็ดซึ่งมีส่วนผสมของแบคทีเรียที่มีอาร์เอ็นเอสายคู่ แสดงผลในการลดลงของไวรัสแหลมสิงห์ ซึ่งนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของน้ำหนักกุ้งเช่นกัน จากการพัฒนาระบบการ ส่งผ่านสารอาร์เอ็นเอสายคู่นี้ สามารถส่งผ่านอาร์เอ็นเอสายคู่เข้าสู่กุ้งในระยะ PL และ juvenile โดยการใช้อาร์ทีเมีย และอาหารเม็ดเป็นตัวกลางในการขนส่งอาร์เอ็นเอสายคู่