Role of lactic acid bacteria in soy sauce fermentation

Abstract

Soy sauce is a very popular condiment worldwide especially in Asia. Japanese and Thai soy sauce processes depend on fermentation of three major microorganisms; koji mold, lactic acid bacteria and yeast. The production of Thai soy sauce nowadays utilizes pure koji mold cultivation. However, it still depends on naturally occurring lactic acid bacteria and yeast fermentations. In order to improve the process, attempts to produce pure cultures of lactic acid bacteria suitable for soy sauce fermentation have been carried out. In this study, 132 soy sauce samples at different ages were collected during moromi fermentation from 2 factories, A and B located in Bangkok and the total bacteria, lactic acid bacteria (LAB), yeast, pH and % total acidity (expressed as % lactic acid) were determined. The results showed that the total bacterial counts on 15-BHI agars ranged from 3.3x10(5) to 5.3x10(6) CFU/ml on the first day of fermentation, reached a maximum of 7.6x10(6) to 2.0xlO(9) CFU/ml during 21 to 41 days, and decreased to l.Ox10(3) - 1.2xlO(6) CFU/ml on the last day of fermentation (67 to 120 days). The amounts of LAB on 15-MRS agars (plus cycloheximide and sodium azide) were initially about 6.0x10(5) - 3.1x10(6) CFU/ml and decreased to lx10(2) - 1.3x10(5) CFU/ml during 10 days of fermentation. The highest number of LAB ranged 4.3x10(6) - 5.0xlO(8) CFU/ml during 21-41 days. The LAB decreased to 10(2) - 10(6) CFU/ml by the last day of fermentation. The numbers of yeasts on 10-YM agar were 6.0x10(2)- 3.4x10(4) CFU/ml from 4 -14 days and gradually increased to the maximum of 8.5x10(4) to 2.5x10(7) CFU/ml during 19-30 days. The amount of yeast decreased and increased again to the maximum of 3.0x10(4) - 6.8x10(5) CFU/ml during 42-91 days. The yeast decreased to l.Ox10(2) to 4.7x10(4) CFU/ml by the last day of fermentation.

ซีอิ๊วเป็นซอสปรุงรสที่ได้รับความนิยมทั่วโลก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในแถบทวีปเอเชีย การหมักซีอิ๊วเป็นผล ของเชื้อจุลินทรีย์ 3 ชนิดทำงานร่วมกัน ได้แก่ เชื้อรา เชื้อแลคติคแอสิดแบคทีเรีย และยีสต์ การหมักซีอิ๊วของไทย ในปัจจุบันได้มีการพัฒนาใช้หัวเชื้อราบริสุทธิ์ เฉพาะใน ขั้นต้นของการหมัก และปล่อยให้การหมักเป็นไปตามธรรมชาติ จนสิ้นสุดขบวนการ ดังนั้นเพื่อที่จะพัฒนาคุณภาพและรักษา ผลิตภัณฑ์จึงพยายามทำหัวเชื้อแลคติคแอสิดแบคทีเรีย ซึ่ง จะควบคุมการหมักและคุณภาพของผลิตภัณฑ์ได้ง่ายขึ้น รวมทั้ง ช่วยลดระยะเวลาในการหมักอีกด้วย ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ทำการวิเคราะห์หาจำนวนเชื้อ แบคทีเรียทั้งหมด จำนวนเชื้อแลคติคแบคทีเรียทั้งหมด และจำนวนเชื้อยีสต์ทั้งหมด รวมทั้ง ค่า pH และปริมาณกรด ในรูปของกรดแลคติค นอกจากนั้นยังทำการแยกและจำแนก ชนิดของเชื้อแลคติคแอสิดแบคทีเรีย จากตัวอย่างซีอิ๊วอายุ ต่าง ๆ กัน ตั้งแต่เริ่มต้น จนถึงวันสุดท้ายของการหมัก โคจิในน้ำเกลือ (การหมักโมโรมิ) รวมทั้งสิ้น 132 ตัวอย่าง ที่เก็บมาจากโรงงานซีอิ๊ว 2 แห่ง คือ A และ B ในเขต กรุงเทพ ผลปรากฏว่าจำนวนเชื้อแบคทีเรียทั้งหมด บนจาน อาหารเลี้ยงเชื้อ 15-BHI อยู่ในช่วง 3.3x10(5) - 5.3x10(6) CFU/ml ในวันแรกของการหมัก จำนวนสูงสุด ของเชื้อแบคทีเรียทั้งหมดนี้จะอยู่ระหว่าง 7.6x10(6) - 2.0x10(9) CFU/ml ในวันที่ 21 ถึง 41 ของการหมัก จากนั้นมีจำนวนลดลงอยู่ระหว่าง 1.0x10(3) - 1.2x10(6) CFU/ml ในช่วงวันสุดท้ายของการหมัก (67-120 วัน) จำนวนเชื้อแลคติคแอสิคแบคทีเรีย บนจานอาหารเลี้ยง เชื้อ 15-MRS (ซึ่งมี cycloheximide และ sodium azide เป็นสารยับยั้ง) มีจำนวนเริ่มต้นอยู่ในช่วง 6.0x10(5) - 3.1x10(6) CFU/ml จากนั้นจำนวนเชื้อเหล่านี้จะลดลงจน เหลือ 1.0x10(2) - 1.3x10(5) CFU/ml ในช่วง 10 วันแรกของการหมัก และจำนวนสูงสุดของเชื้อเหล่านี้อยู่ ระหว่าง 4.3x10(6) - 5.0x10(8) CFU/ml ในช่วง วันที่ 21 ถึง 41 ของการหมัก จากนั้นค่อย ๆ ลดจำนวนลง จนถึงวันสุดท้ายของการหมัก จะมีเชื้อประมาณ 10(2) - 10(6) CFU/ml สำหรับเชื้อยีสต์ที่พบบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อ 10-YM มีจำนวนอยู่ในช่วง 6.0x10(2) ถึง 3.4x10(4) CFU/ml ในวันที่ 4 - 14 ของการหมัก จากนั้นจำนวนเชื้อจะเพิ่ม ขึ้นจนมีค่าสูงสุดในช่วงแรก 8.5x10(4) - 2.5x10(7) CFU/ml ในระหว่างวันที่ 19-30 จำนวนเชื้อยีสต์จะลดลง และเพิ่มขึ้นสูงสุดอีกในระดับ 3.0x10(4) - 6.8x10(5) CFU/ml ในระหว่างวันที่ 42-91 ต่อมายีสต์จะลดลงจนมี จำนวนระหว่าง 1.0x10(2) - 4.7x10(4) CFU/ml ในวันสุดท้ายของการหมัก สำหรับ pH ของน้ำหมักซีอิ๊วเหล่านี้จะอยู่ระหว่าง 5.7-6.0 ในวันแรกและ 4.8-5.4 ในวันสุดท้ายของการหมัก และมีปริมาณกรดแลคติคอยู่ในช่วง 0.1-0.8% ในวันแรก และ 1.9 ถึง 2.8% ในวันสุดท้ายของการหมัก จากการแยกเชื้อแลคติคแอสิดแบคทีเรียจากจารอาหาร เลี้ยงเชื้อ 15-MRS ดังกล่าวข้างต้น ได้เชื้อแบคทีเรีย ทั้งสิ้น 507 สายพันธุ์ ในจำนวนนี้ 447 สายพันธุ์เป็นเชื้อ แลคติคแอสิดแบคทีเรียที่ย้อมติดสีแกรมบวก รูปร่างกลม และ จัดเรียงตัวเป็นแบบคู่สี่ เป็นพวก Facultative anaerobe ไม่สามารถสร้างเอมไซม์ catalase สามารถเจริญได้ที่ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส แต่ไม่เจริญที่อุณหภูมิ 45 องศา เซลเซียส เชื้อเหล่านี้เจริญได้ดีใน pH 9.6 และ 8.5 แต่เจริญได้น้อยมากใน pH 4.5 และ ไม่เจริญใน pH 4.2 เชื้อเหล่านี้ต้องเติบโตและเจริญดีในที่ ๆ มีเกลือในอาหาร เลี้ยงเชื้อที่มีความเข้มข้นของเกลือระหว่าง 5% ถึง 15% เชื้อเหล่านี้ถูกจัดอยู่ในกลุ่ม tetratogenococcus halophilus และสามารถตรวจพบเชื้อเหล่านี้ได้ตลอดระยะ เวลาของการหมักซีอิ๊ว ส่วนเชื้อที่เหลือจำนวน 60 สายพันธุ์ นั้น ถึงแม้ว่าจะมีลักษณะทางสรีรวิทยาเหมือนกัน แต่มัน สามารถสร้างเอนไซม์ catalase ได้ ในจำนวนนี้ถูกจัด เป็น Micrococcus sp. 12 สายพันธุ์ และ Staphylococcus sp. 48 สายพันธุ์ บางสายพันธุ์ของ Staphylococcus sp และทุก ๆ สายพันธุ์ของ Micrococcus sp จะพบในช่วง 20 วันแรกของการหมัก และไม่พบเชื้อซีอิ๊วอายุเกิน 20 วัน เชื้อ T. halophilus สายพันธุ์ TS71, TS72 และ NC133 ถูกคัดเลือกว่าเป็นเชื้อที่มีความเหมาะสมในการทำ หัวเชื้อบริสุทธิ์จากข้อกำหนดดังนี้ 1) อยู่ในช่วงเวลาที่ มีเชื้อแลคติคแอสิดแบคทีเรียสูงที่สุด 2) สามารถเจริญได้ เร็วมากในเกลือที่มีความเข้มข้นสูง ๆ และ 3) สามารถใช้ น้ำตาลได้หลายชนิดเพื่อการเจริญเติบโต (glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose) เชื้อทั้งสามสายพันธุ์เจริญ ได้ดีในเกลือความเข้มข้น 18, 15, 10, 20 และ 5 % ตามลำดับ และยังพบว่าทั้ง 3 สายพันธุ์มีรูปแบบและอัตราการ เจริญเติบโตที่เหมือนกัน เมื่อนำสายพันธุ์ TS71 และ NC133 มาศึกษาการเจริญ เติบโตร่วมกันกับเชื้อยีสต์ (Zygosaccharomyces rouxii) ในน้ำซีอิ๊วดิบอายุ 20 วัน พบว่า TS71 และ NC133 เจริญ ได้ดีมากขึ้นเมื่ออยู่ร่วมกับ Z. rouxii แต่เชื้อสายพันธุ์ ดังกล่าวไม่ได้มีผลต่อการเจริญเติบโตของ Z. rouxii จากการทำหัวเชื้อบริสุทธิ์ของ T. halophilus TS71 และการทำแห้งโดยวิธี Spray Dry ในขั้นต้นพบว่าจำนวนเชื้อ ก่อนทำ Spray Dry มีค่า 8.4x10(7) CFU/ml และลดลง ประมาณ 1 log เหลือ 5.9x10(6) CFU/ml หลังการทำ Spray Dry โดยใช้ 30 % (w/v) dextrin เป็น carrier เชื้อผงเหล่านี้ เก็บใน desiccator ได้นาน 3 อาทิตย์ที่อุณหภูมิห้อง