Chitinolytic enzymes of Bacillus licheniformis : partial purification, characterization and mosquito larvicidal property

Abstract

The Bacillus licheniformis, isolated by our laboratoly, produce,d chitinolytic enzymes when cells grown in medium supplemented with crude chitin entered the stationary phase. This Bacillus lichenifornus strain produced at least 5 types of chitinolytic enzymes and their molecular weights were 70.8, 68.1, 63.7, 53.0, and 49.5 kDa. The chitinolytic enzyme from culture supernatant of cells grown in medium supplemented with chitin was purified by fractionation with ammonium sulfate ranges from 35-65 percent and passed through column chromatography with CM- and 2 columns of DEAE-sephadex matrix respectively. The pure fraction of chitinase with molecular weight of 70.8 kDa was obtained. Results of physicochemical properties of purified enzyme showed optimal temperature of 60 degree C relatively stable when kept at 40 and 50 degree C with optimal pH of 5.0. Its activity was rapidly lost when kept in strong acid, strong alkali or high temperature (>= 70 degree C), but very stable in deionized distilled water. Enzyme kinetics study showed that Michaeliss constant (Km)) and maximum velocity (Vm)) value were 3.33 % (w/v) and 781.90 mU/ml/mg of enzyme, respectively. Crude fraction and purified 70.8 kDa chitinolytic enzyme were assayed for toxicity against mosquito larvae. The LC50 of crude chitinolytic enzymes against 2nd instar of Aedes aeapti larvae was 60.67 mU/ml. These enzymes enhanced toxicity effect when assayed against mosquito larvae in combination with Bacillus thuringiensis subsp. israelensis strain 4Q2-72. The crude enzyme fraction alone was completely lost its larvicidal properly upon heating at 100 degree C for 10 min. The LC50 of purified 70.8 kDa chitinolytic enzyme against 2nd instar of Aedes aegypti larvae was equal to 66.67 mU/ml.

แบคทีเรีย Bacillus licheniformis สายพันธุ์ ที่แยกได้จากห้องปฏิบัติการ สามารถผลิตเอนไซม์ไคตินเนส ได้เป็นจำนวนมากเมื่อแบคทีเรียชนิดนี้ถูกเพาะเลี้ยงใน อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีไคตินเป็นส่วนผสมเมื่อเซลล์เข้าสู่ ช่วง stationary phase โดยที่เอนไซม์ไคติตเนสที่ผลิต ได้มีอยู่อย่างน้อย 5 ชนิดและมีขนาด 70.8, 68.1, 63.7, 53.0 และ 49.5 kDa เอนไซม์ขนาด 70.8 kDa ถูกแยก ให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธี fractionation ของส่วนน้ำเพาะเชื้อ ของแบคทีเรียชนิดนี้ด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต ช่วง 35-65 เปอร์เซ็นต์ และ column chromatography ด้วย CM- และ DEAE-sephadex matrix ตามลำดับ จากนั้นจึงมีการศึกษา คุณสมบัติ physicochemical ในด้านต่าง ๆ พบว่า เอนไซม์ มี optimal temperature ที่ 60 องศาเซลเซียใ และ activity ค่อนข้างคงทน เมื่อเก็บที่ 40-50 องศาเซลเซียส และพบว่า activity ของเอนไซม์จะลดลงอย่างมากเมื่อ เอนไซม์อยู่ในสารละลายที่มีภาวะเป็นกรด, ด่าง หรือ อุณหภูมิสูง (>= 70 องศาเซลเซียส), activity จะคงทน มากเมื่อเอสไซม์ถูกเก็บอยู่ในน้ำกลั่น จากการศึกษา enzyme kinetics ได้ค่า Michaeliss constant และ maximum velocity (Vm) ของเอนไซม์ชนิดนี้มีค่า 3.33 เปอร์เซ็นต์ และ 781.90 mU/ml/mg ตามลำดับ จากการทดสอบความ สามารถในการฆ่าลูกน้ำยุง Aedes aegypti ของ crude fraction ของเอนไซม์ไคตินเนสซึ่งเตรียมโดยวิธี fractionation ด้วย แอมโมเนียมซัลเฟต ช่วง 35-65 เปอร์เซ็นต์ และเอนไซม์ไคตินเนส ขนาด 70.8 kDa ที่บริสุทธิ์ ได้ค่า LC50 ของ crude fraction มีค่าเท่ากับ 60.67 mU/ml และพบการเสริมประสิทธิภาพในการฆ่าลูกน้ำยุง Aedes aegypti เมื่อมีการทดสอบ crude fraction นี้ ร่วมกับ Bacillus thuringiensis subsp. israelensis สายพันธุ์ 4Q2-72 และ crude fraction จะสูญเสียคุณสมบัติ ในการฆ่าลูกน้ำยุงถ้าถูกต้มที่ 100 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที และจากการศึกษาผลของเอนไซม์ไคตินเนสขนาด 70.8 kDa ที่บริสุทธิ์ในการฆ่าลูกน้ำยุง Aedes aegypti พบว่า ค่า LC50 ของเอนไซม์ชนิดนี้มีค่าเท่ากับ 66.67 mU/ml