Comparison of endotoxin quantitative test methods in intravenous pharmaceutical products

Abstract

Endotoxin is a biological pyrogen obtained from the lipid A-part of outer membrane lipopolysaccharide (LPS) in Gram-negative bacteria. Contaminated endotoxin in blood circulation can stimulate the immune system by releasing inflammatory cytokines leading to fever, multiple organ failure (MOF) and multiple organ dysfunction syndrome (MODS). Therefore, contaminated endotoxin in intravenous pharmaceutical products can increase the severity of the illness and the mortality rate of patients. To reduce this problem, quantification of endotoxin contamination in sterile pharmaceutical products is regulation in the quality control processes. For standard methods, endotoxin was quantified using Limulus amebocyte lysate (LAL) based assays: gel clot, turbidimetric and chromogenic methods. Recently, an alternative method, using a recombinant Factor C (rFC), has been available for measuring endotoxin. The aim of study was to comparatively evaluate the LAL kinetic turbidimetric and rFC endpoint fluorescence methods for measuring endotoxins in five intravenous pharmaceutical products, i.e., Lidocaine, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Ondansetron and Meropenem for Injections. Two groups of assayed samples used in this study included group A; spike standard endotoxin (0.495 EU/mL) into an appropriated dilution of samples and group B; spike standard endotoxin (0.495 EU/mL) into an appropriated dilution of samples with pre-added standard endotoxin (10 EU/mL). For group A, the Wilcoxon matchedโ€pairs signed rank test (P < 0.05) showed that both methods for endotoxin detection were significantly different from all testing samples. The data points of endotoxin detected by rFC endpoint fluorescence methods were deviated less from the zero-line, which represented a different value from 0.495 EU/ml of standard endotoxin added to the appropriately diluted samples, when compared with the LAL kinetic turbidimetric method. Moreover, the accuracy (%recovery) of endotoxin detected by the rFC endpoint fluorescence methods showed a higher result than the kinetic turbidimetric method. Thus, the rFC endpoint fluorescence method provided a high accuracy for endotoxin detection as represented by %recovery which was closest to 100%. In addition, the statistical analysis for group B showed an insignificant difference between both methods compared by Wilcoxon matched-pairs signed rank test (p<0.05) for all testing samples. However, the deviation from the zero-line of endotoxin detection by the LAL kinetic turbidimetric method was less than the rFC method. Moreover, the accuracy (% recovery) of endotoxin detection by the LAL kinetic turbidimetric method provided a high accuracy for endotoxin detection as represented by %recovery, which was closest to 100%. It can be concluded that the rFC endpoint fluorescence method was appropriate for endotoxin detection, especially at low levels, and might be developed for to be the standard method of endotoxin or pyrogen detection in sterile pharmaceutical products, in the future.

ชีวพิษภายในตัวคือสารก่อไข้ทางชีวภาพที่ได้จากส่วนลิพิดเอของผนังด้านนอกลิพอพอลิแซ็กคาไรด์ (LPS) ในแบคทีเรียแกรมลบ การปนเปื้อนชีวพิษภายในระบบหมุนเวียนเลือดจะสามารถกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกัน โดยการหลั่งสารไซโตไคน์ที่กระตุ้นการอักเสบ ทำให้เกิดไข้ การทำงานของอวัยวะหลายชนิดล้มเหลว (MOF) และกลุ่มอาการอวัยวะทำหน้าที่ผิดปกติ (MODS) ดังนั้นชีวพิษภายในตัวที่ปนเปื้อนในเภสัชภัณฑ์ที่ให้ทางหลอดเลือดดำ จะเพิ่มความรุนแรงและอัตราการตายของผู้ป่วย เพื่อลดปัญหานี้ การหาปริมาณชีวพิษภายในตัวที่ปนเปื้อนในเภสัชภัณฑ์ปราศจากเชื้อเป็นข้อกำหนดในกระบวนการควบคุมคุณภาพ สำหรับวิธีมาตรฐาน ชีวพิษภายในตัวถูกวัดปริมาณโดยใช้การทดสอบ Limulus amebocyte lysate (LAL) คือวิธี gel clot turbidimetric และ chromogenic เมื่อเร็ว ๆ นี้ วิธีทางเลือก recombinant Factor C (rFC) ถูกนามาใช้สำหรับวัดปริมาณชีวพิษภายในตัว จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการประเมินเชิงเปรียบเทียบของวิธี LAL kinetic turbidimetric และ rFC endpoint fluorescence เพื่อวัดปริมาณชีวพิษภายในตัวใน 5 ตัวอย่างเภสัชภัณฑ์ที่ให้ทางหลอดเลือดดำ ได้แก่ Lidocaine, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Ondansetron and Meropenem สำหรับฉีด ตัวอย่างทั้ง 2 กลุ่มถูกใช้ในการศึกษาครั้งนี้ประกอบด้วย กลุ่ม A เติม 0.495 EU/มล. ของชีวพิษภายในตัวมาตรฐานลงในตัวอย่างที่เจือจางด้วยความเข้มข้นที่เหมาะสม และ กลุ่ม B เติม 0.495 EU/มล. ของชีวพิษภายในตัวมาตรฐานลงในตัวอย่างที่มีการเติม10 EU/มลก่อนเจือจางด้วยความเข้มข้นที่เหมาะสม สำหรับกลุ่ม A การทดสอบสถิติ Wilcoxon matched-pairs signed rank test (P < 0.05) แสดงถึงทั้งสองวิธีสำหรับการตรวจหาชีวพิษภายในตัวนั้นแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างทั้งหมดที่ใช้ทดสอบ ข้อมูลที่ได้จากการตรวจหาชีวพิษภายในตัวโดยวิธี rFC endpoint fluorescence เบี่ยงเบนจากเส้น 0 น้อยกว่า ซึ่งแสดงถึงค่าความต่างจาก 0.495 EU/มล. ของชีวพิษภายในตัวมาตรฐานที่เติมลงในตัวอย่างที่เจือจางด้วยความเข้มข้นที่เหมาะสม เมื่อเปรียบเทียบกับวิธี LAL kinetic turbidimetric ยิ่งไปกว่านั้น ค่าความถูกต้อง (% recovery) ของการตรวจหาชีวพิษภายในตัวด้วยวิธี rFC endpoint fluorescence นั้นให้ผลสูงกว่าวิธี LAL kinetic turbidimetric ดังนั้นวิธี rFC endpoint fluorescence ให้ผลที่แม่นยำสูงสำหรับการตรวจหาชีวพิษภายในตัวซึ่งแสดงโดย% recovery ที่ใกล้เคียง 100% นอกจากนั้นการวิเคราะห์ทางสถิติสำหรับกลุ่ม B แสดงให้เห็นความแตกต่างอย่างไม่มีนัยสำคัญระหว่างการเปรียบเทียบ 2 วิธีโดยสถิติ Wilcoxon matched-pairs signed rank test (P < 0.05) ในตัวอย่างทั้งหมดที่ใช้ทดสอบ อย่างไรก็ตาม การเบี่ยงเบนจากเส้น 0 ของการตราจหาชีวพิษภายในตัวด้วยวิธี LAL kinetic turbidimetric น้อยกว่าวิธี rFC endpoint fluorescence ยิ่งไปกว่านั้นค่าความถูกต้อง (% recovery) ของการตรวจหาชีวพิษภายในตัวด้วยวิธี LAL kinetic turbidimetric แสดงผล แม่นยำสูงสำหรับการตรวจหาชีวพิษภายในตัวซึ่งแสดงโดย% recovery ที่ใกล้เคียง 100% ผลการวิจัยสรุปได้ว่าวิธี rFC endpoint fluorescence เป็นเทคนิคที่เหมาะสำหรับตรวจหาชีวพิษภายในตัวโดยเฉพาะปริมาณน้อยและอาจได้รับการพัฒนาสำหรับการเป็นวิธีการมาตรฐานของสารพิษของการตรวจหาชีวพิษภายในตัวหรือสารก่อไข้ในเภสัชภัณฑ์ที่ให้ทางหลอดเลือดดำในอนาคตอันใกล้นี้