Comparative study of [alpha]-hydroxynitrile lyases from different tissues of cassava

Abstract

In the cyanogenesis of cassava (Manihot esculenta Crantz.), [alpha]-Hydroxynitrile lyase (HNL) catalyses the dissociation of acetone cyanohydrin derived from linamarin into acetone and toxic hydrogen cyanide . The purified HNL from young cassava leaf showed a specific activity of 46.84 umol/min/mg while that from cassava stem had a specific activity of 4.90 umol/min/mg. The purification steps consisted of 60-80% ammonium sulfate precipitation, followed by gel filtration chromatography using a Sephacryl S-300 column and anion-exchange fast protein liquid chromography using a Q-Sepharose column. The native molecular weight of HNL from young leaf was found to be 125,000 by using Sephadex G-200 column but that of the enzyme from stem was found to be 89,000. The subunit molecular weight was estimated to be 30,000 by SDS-PAGE for both young leaf and stem enzymes. Therefore, HNL from young leaf was homotetrameric but HNL from stem was homotrimeric. Modifications of arginine, cysteine, histidine, serine and tryptophan residues of HNL each caused a nearly complete loss of the enzyme activity. However, modifications of carboxyl, lysine and tyrosine each caused less loss of the HNL activity than the losses due to modification of other residues. In addition, glycine ethyl ester which was used in the carboxyl residue modification was inhibitory to HNL activity by itself. The loss of activity due to the modifications of arginine and serine residues was reduced in the presence of a competitive inhibitor. These data suggest that arginine and serine are important in catalytic site of HNL. Since HNLs from cassava leaf, stem and petiole are similarly affected by each modifying reagent, their active sites should have the same residues.

อัลฟา-ไฮดรอกซีไนไตรไลเอส (HNL) เร่งการแตกตัวของอะซีโตนไซยาโนไฮดริน ที่ได้จากลินามารินไปเป็นอะซีโตนและไฮโดรเจนไซยาไนด์ ซึ่งเป็นพิษในกระบวนการไซยาโนจีนีซิส ในมันสำปะหลัง (Manihot esculenta Crantz.) เอนไซม์ HNL ที่ผ่านกระบวนการ ทำให้บริสุทธิ์จากใบอ่อนของมันสำปะหลังมีแอคทิวิตี้จำเพาะเท่ากับ 46.84 ไมโครโมลต่อ นาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน ขณะที่เอนไซม์นี้จากลำต้นมันสำปะหลังมีแอคทิวิตี้จำเพาะเท่ากับ 4.90 ไมโครโมลต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ประกอบด้วยการตกตะกอน ด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตที่ 60-80% อิ่มตัวตามด้วยเจลฟิลเตรชั่นโครมาโตรกราฟีบน คอลัมน์เซฟฟคริลเอส-300 และ FPLC โดยใช้คอลัมน์ anion exchange Q-Sepharose จากการใช้คอลัมน์เซฟฟเด็กซ์จี-200 พบว่าน้ำหนักโมเลกุลของเอนไซม์ HNL จากใบอ่อน เป็น 125,000 แต่เอนไซม์จากลำต้นเป็น 89,000 น้ำหนักโมเลกุลของหน่วยย่อยโดยใช้ SDS-PAGE ถูกประมาณว่าเท่ากับ 30,000 ทั้งในเอนไซม์จากใบอ่อนและลำต้น ดังนั้น เอนไซม์ HNL จากใบอ่อนประกอบด้วย 4 หน่วยย่อย แต่เอนไซม์จากลำต้นประกอบด้วย 3 หน่วยย่อย การดัดแปลงในแต่ละกลุ่มอาร์จินีน ซิสเตอีน ฮิสติดีน ซีรีน และทริปโตเฟน ในเอนไซม์ HNL ก่อให้เกิดการลดลงจนเกือบสมบูรณ์ของแอคทิวิตี้ของเอนไซม์ อย่างไร ก็ตามการดัดแปลงกลุ่มคาร์บอกซิล ไลซีนและไทโรซีน ก่อให้เกิดการลดลงของเอนไซม์ HNL น้อยกว่าการดัดแปลงของกลุ่มอื่นๆ นอกเหนือจากนั้น ไกลซีนเอธิลเอสเทอร์ ซึ่งถูกใช้ ในการดัดแปลงกลุ่มคาร์บอกซิล ยังเป็นตัวยับยั้งแอคทิวิตี้ของเอนไซม์ HNL ด้วยตัวของ มันเองอีกด้วย การลดลงของแอคทิวิตี้เนื่องจากการดัดแปลงของแต่ละกลุ่มอาร์จินีน และซีรีนถูกทำให้ลดลงในขณะที่มีตัวยับยั้งแบบแข่งขัน ข้อมูลนี้เสนอว่าอาร์จินีนและซีรีน มีความสำคัญในบริเวณเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ HNL โดยเหตุที่แต่ละสารดัดแปลงมีผล ต่อเอนไซม์ HNL จากใบ ลำต้น และก้านใบของมันสำปะหลังเหมือนๆ กัน เพราะฉะนั้น บริเวณเร่งปฏิกิริยาของมันควรจะมีกลุ่มอะมิโนเหมือนๆ กัน