Complementary DNA cloning of aspergillus niger glucoamylase gene

Abstract

Total RNA was isolated from Aspergillus niger GA36, a high glucoamylase activity strain, by using the TRIzol(TM) extraction method. Poly (A)+ RNA was purified from total RNA on an Oligo (dT) Cellulose Column and used as a template for the synthesis of first strand cDNA by using SuperScript RNase H- RT (Reverse Transcriptase) in the 3 RACE System (Rapid Amplification of cDNA Ends). Second strand cDNA was then synthesized by the PCR technique with two primers [oli 20 (5-end) and oli 118 (3-end)] and double-stranded cDNA was amplified by the same technique. The full-length double-stranded cDNA of the A.niger GA36 glucoamylase gene (about 2.1 kb) was cloned into the 3.9 kb pCR(TM) I vector and the recombinant plasmid was introduced into E. coli INVαF. E. coli transformants containing the 2.1 kb insert were screened by restriction endonuclease analysis with EcoRI to confirm the presence of the glucoamylase gene by Southern blot hybridization of EcoRI-digested plasmids with a 700 bp probe. This probe was derived from a PCR amplified product of the A. niger 3124 genomic glucoamylase gene using the non-radioisotopic digoxigenin random prime labeling and detection system. Two positive clones containing 2.1 kb fragments of the glucoamylase gene were obtained from thirty-five white colonies on the X-Gal plate. The restriction map revealed that this 2.1 kb EcoRI fragment contained several unique restriction sites including BamHI, BstXI, PstI, PvuII, Salt and two KpnI. Several sites were similar to that of reported glucoamylase gene. This provided strong evidence that the clone cDNA gene from this study was the glucoamylase gene.

ได้ทำการสกัด total RNA ด้วยวิธี TRIzol(TM) จาก เชื้อรา Aspergillus niger GA36 ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่ผลิต เอนไซม์กลูโคอะไมเลสได้สูง จากนั้นทำการแยก Poly(A)(+) RNA ออกจาก total RNA ด้วยวิธี Oligo (dT) Cellulose Column Poly(A)(+) RNA ที่ได้ถูกนำไปใช้เป็นแม่แบบสำหรับ สังเคราะห์ cDNA เส้นที่หนึ่ง โดยการใช้เอนไซม์ SuperScript RNase H(-) Reverse Transcriptase ตามวิธีของ 3 RACE System (Rapid Amplification of cDNA Ends) cDNA เส้นที่สองได้ถูกสังเคราะห์ขึ้นโดยวิธี PCR โดยใช้ oli 20 ที่ปลาย 5 และ oli 118 ที่ปลาย 3 เป็น primer และได้ใช้เทคนิคเดียวกันนี้ในการเพิ่มจำนวน double-stranded cDNA ยีนกลูโคอะไมเลส cDNA ของเชื้อ A. niger GA36 ที่ ได้มีความยาวประมาณ 2.1 กิโลเบส หลังจากโคลน cDNA เข้า กับดีเอ็นเอพาหะ pCR(TM)II (ความยาว 3.9 กิโลเบส) แล้ว ได้นำดีเอ็นเอสายผสมดังกล่าว ไปทรานสฟอร์มเข้า E. coli INVαF จากนั้นทำการคัดเลือกทรานสฟอร์แมนที่มีชิ้นส่วน ของยีนขนาด 2.1 กิโลเบส ด้วยการตัดย่อยด้วยเอนไซม์ตัด จำเพาะ EcoRI และทำการตรวจยืนยันพลาสมิดที่ตัดด้วย EcoRI ว่ามียีนกลูโคอะไมเลสด้วยวิธี Southern blot hybridization โดยใช้ดีเอ็นเอติดตามขนาด 700 คู่เบส ซึ่งได้มาจากการเพิ่มจำนวนด้วยวิธี PCR จากยีนกลูโคอะไมเลส ของเชื้อรา A. niger 3124 การทดลองนี้ได้ใช้การติดฉลาก ด้วยสารปลอดรังสี (Digoxigenin random prime labeling and detection system) จากจำนวนโคโลนีสีขาว 35 โคโลนี บนอาหารที่มี X-Gal พบว่ามี 2 โคโลนี ที่มียีนกลูโคอะไมเลส cDNA ความยาว 2.1 กิโลเบส เมื่อตัดย่อยยีนกลูโคอะไมเลส cDNA ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ พบว่ามี 1 ตำแหน่งที่ตัดด้วย BamHI, BstXI, PstI, PvuII, SalI และ 2 ตำแหน่งที่ ตัดด้วย KpnI โดยมีหลายตำแหน่งที่เหมือนกับยีนกลูโคอะไมเลส ที่เคยมีผู้รายงานไว้ จากหลักฐานที่ได้กล่าวมานี้ สามารถระบุได้ ว่ายีน cDNA โคลนจากการศึกษานี้เป็นยีนกลูโคอะไมเลส