Determination of organic acids produced by Plasmodium Falciparum using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
Issued Date
2024
Copyright Date
2017
Resource Type
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xiii, 76 leaves : ill.
Access Rights
open access
Rights
ผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้า
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (M.Sc. (Tropical Medicine))--Mahidol University, 2017
Suggested Citation
Parsakorn Tapaopong Determination of organic acids produced by Plasmodium Falciparum using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Thesis (M.Sc. (Tropical Medicine))--Mahidol University, 2017. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/92484
Title
Determination of organic acids produced by Plasmodium Falciparum using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
Alternative Title(s)
การตรวจวัดกรดอินทรีย์ที่สร้างจากเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิปารัม ด้วยวิธีลิควิดโครมาโตกราฟี-แมสสเปดโทรเมตรี
Author(s)
Abstract
Lactic acid (LA) levels are usually measured in patients with acidosis. LA is a major product of the malaria parasite's consumption of glucose to meet its energy requirements. Previous studies have determined other organic acids, in addition to LA, and examined their roles in the pathogenesis of severe malaria patients. This study aimed to determine the source of the organic acids commonly found in patients, focusing on parasite-released products. P. falciparum strain TM267 samples were synchronized with 5% D-sorbitol to yield a high percentage of ring-stage samples. Supernatants from malaria culture were collected from 4 stages--ring form, trophozoite, schizont, and post-schizont rupture. Mass spectrometer (MS) tuning was performed to acquire the target mass (m/z) of 4 acids and internal standards. Also, Liquid chromatography (LC) conditions were tested to determine the optimum pattern of chromatogram and retention time (tR). The organic acids detected were quantitated by establishing a calibration curve from standard solutions. Samples were prepared by solid phase extraction (SPE) in order to remove unwanted impurities, which might influence the LC-MS system. LA was found to be a statistically significant (P < 0.05) parasite product in every stage. No statistically significant traces of other acids were found with this specific LC-MS method even when using isolated parasites and higher parasitaemia levels. The LC-MS method was shown to be sensitive, reproducible, and appropriate for small sample volumes. However, full validation methods are needed to improve the accuracy of acid quantitation. The use of a culture medium with amino acid depletion is an alternative for further study, to avoid the competition between amino acids and candidate acids at ion exchange sites during the SPE process. Acid fragility and lability are also important topics for further investigation. LA was found to be a P. falciparum product at different concentrations in each stage, while phydroxyphenyllactic acid (pHPLA), α-hydroxybutyric acid (aHBA), and β-hydroxybutyric acid (bHBA) were not detectable at significant levels using this specific LC-MS method. Amino acid depletion of culture medium and acid stability should be further investigated to achieve other aspect for future studies.
กรดแลคติกสามารถตรวจวัดได้ตามปกติในผู้ป่วยมาลาเรียชนิดรุนแรงที่มีภาวะเลือดเป็นกรด และเป็นที่ทราบว่า กรดชนิดนี้ถูกสร้างจากตัวเชื้อโดยอาศัยการย่อยสลายน้ำตาลกลูโคสในเลือดเพื่อเป็นแหล่งพลังงานจากผลการศึกษาของงานวิจัยก่อนหน้าพบว่า ยังมีกรดอินทรีย์ชนิดอื่น ๆ นอกเหนือจากกรดแลคติก มีบทบาททางพยาธิสภาพกับคนไข้ในภาวะดังกล่าว จึงเป็นที่มาของวัตถุประสงค์งานวิจัยฉบับนี้ เพื่อต้องการระบุแหล่งที่มาของกรดอินทรีย์เหล่านั้น โดยใช้วิธีการตรวจวัดโดยตรงจากสารคัดหลั่งของเชื้อมาลาเรีย อาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้หลังจากการเลี้ยงเชื้อมาลาเรียชนิด P. falciparum สายพันธุ์ TM267 ถูกเก็บเพื่อนำไปตรวจวัดกรดอินทรีย์ด้วยวิธีลิควิดโคร มาโตกราฟี - แมสสเปกโทรเมตรี โดยจำแนกตามระยะต่าง ๆ ได้แก่ ring, trophozoite, schizont, และระยะหลังการแตกตัวของ schizont โดยวิธีการตรวจวัดดังกล่าวเริ่มจากการหาสัดส่วนมวลต่อประจุ (m/z) ของกรดอินทรีย์ที่กำลังศึกษา จากนั้นทำการทดสอบเพื่อหาชนิด อัตราส่วน และสมบัติทางเคมีของเฟสเคลื่อนที่ที่เหมาะสมในการพากรดอินทรีย์ดังกล่าวมาชะออกและแสดงผลในรูปแบบของโครมาโตแกรมที่ระยะเวลา (retention time) ต่าง ๆ กันความเข้มข้นของกรดอินทรีย์ถูกตรวจวัดโดยการสร้างเส้นโค้งสอบเทียบ (calibration curve) จากสารละลายมาตรฐาน (standard solution) โดยสารตัวอย่าง (sample) ทั้งหมดจะถูกเตรียมด้วยกระบวนการ solid phase extraction ก่อนนำมาทดสอบ ผลการวิจัยพบว่าเชื้อ P. falciparum สร้างกรดแลคติกออกมาอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P < 0.05) ที่ความเข้มข้นต่างกันในแต่ละระยะ ขณะที่กรดอินทรีย์ชนิดอื่น ๆ ไม่สามารถตรวจวัดได้ด้วยวิธีการดังกล่าว แม้ว่าการศึกษานี้ได้ทดสอบโดยตรงกับตัวเชื้อในปริมาณที่สูงกว่า อาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากกรดอะมิโนเป็นอีกตัวเลือกหนึ่งสำหรับการศึกษาในอนาคต เนื่อจากสันนิษฐานว่าอาจมีผลต่อการชะออกของกรดอินทรีย์ ขณะถูกเตรียมด้วยกระบวนการ solid phase extraction นอกจากนี้อาจมีความเกี่ยวข้องในเรื่องความเสถียรของกรดอินทรีย์ในสารตัวอย่าง ซึ่งจำเป็นต้องศึกษาโดยละเอียดต่อไป อย่างไรก็ตามวิธีลิควิดโครมาโตกราฟี- แมสสเปกโทรเมตรี ที่ถูกพัฒนาขึ้นนั้นมีคุณสมบัติแม่นยำและเหมาะสม ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการนำไปใช้สำหรับการศึกษาครั้งถัดไปที่ต้องการตรวจวัดสารที่มีคุณสมบัติใกล้เคียงกับงานวิจัยฉบับนี้
กรดแลคติกสามารถตรวจวัดได้ตามปกติในผู้ป่วยมาลาเรียชนิดรุนแรงที่มีภาวะเลือดเป็นกรด และเป็นที่ทราบว่า กรดชนิดนี้ถูกสร้างจากตัวเชื้อโดยอาศัยการย่อยสลายน้ำตาลกลูโคสในเลือดเพื่อเป็นแหล่งพลังงานจากผลการศึกษาของงานวิจัยก่อนหน้าพบว่า ยังมีกรดอินทรีย์ชนิดอื่น ๆ นอกเหนือจากกรดแลคติก มีบทบาททางพยาธิสภาพกับคนไข้ในภาวะดังกล่าว จึงเป็นที่มาของวัตถุประสงค์งานวิจัยฉบับนี้ เพื่อต้องการระบุแหล่งที่มาของกรดอินทรีย์เหล่านั้น โดยใช้วิธีการตรวจวัดโดยตรงจากสารคัดหลั่งของเชื้อมาลาเรีย อาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้หลังจากการเลี้ยงเชื้อมาลาเรียชนิด P. falciparum สายพันธุ์ TM267 ถูกเก็บเพื่อนำไปตรวจวัดกรดอินทรีย์ด้วยวิธีลิควิดโคร มาโตกราฟี - แมสสเปกโทรเมตรี โดยจำแนกตามระยะต่าง ๆ ได้แก่ ring, trophozoite, schizont, และระยะหลังการแตกตัวของ schizont โดยวิธีการตรวจวัดดังกล่าวเริ่มจากการหาสัดส่วนมวลต่อประจุ (m/z) ของกรดอินทรีย์ที่กำลังศึกษา จากนั้นทำการทดสอบเพื่อหาชนิด อัตราส่วน และสมบัติทางเคมีของเฟสเคลื่อนที่ที่เหมาะสมในการพากรดอินทรีย์ดังกล่าวมาชะออกและแสดงผลในรูปแบบของโครมาโตแกรมที่ระยะเวลา (retention time) ต่าง ๆ กันความเข้มข้นของกรดอินทรีย์ถูกตรวจวัดโดยการสร้างเส้นโค้งสอบเทียบ (calibration curve) จากสารละลายมาตรฐาน (standard solution) โดยสารตัวอย่าง (sample) ทั้งหมดจะถูกเตรียมด้วยกระบวนการ solid phase extraction ก่อนนำมาทดสอบ ผลการวิจัยพบว่าเชื้อ P. falciparum สร้างกรดแลคติกออกมาอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P < 0.05) ที่ความเข้มข้นต่างกันในแต่ละระยะ ขณะที่กรดอินทรีย์ชนิดอื่น ๆ ไม่สามารถตรวจวัดได้ด้วยวิธีการดังกล่าว แม้ว่าการศึกษานี้ได้ทดสอบโดยตรงกับตัวเชื้อในปริมาณที่สูงกว่า อาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากกรดอะมิโนเป็นอีกตัวเลือกหนึ่งสำหรับการศึกษาในอนาคต เนื่อจากสันนิษฐานว่าอาจมีผลต่อการชะออกของกรดอินทรีย์ ขณะถูกเตรียมด้วยกระบวนการ solid phase extraction นอกจากนี้อาจมีความเกี่ยวข้องในเรื่องความเสถียรของกรดอินทรีย์ในสารตัวอย่าง ซึ่งจำเป็นต้องศึกษาโดยละเอียดต่อไป อย่างไรก็ตามวิธีลิควิดโครมาโตกราฟี- แมสสเปกโทรเมตรี ที่ถูกพัฒนาขึ้นนั้นมีคุณสมบัติแม่นยำและเหมาะสม ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการนำไปใช้สำหรับการศึกษาครั้งถัดไปที่ต้องการตรวจวัดสารที่มีคุณสมบัติใกล้เคียงกับงานวิจัยฉบับนี้
Description
Tropical Medicine (Mahidol University 2017)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's degree
Degree Department
Faculty of Tropical Medicine
Degree Discipline
Tropical Medicine
Degree Grantor(s)
Mahidol University