Molecular study of interactions between Cry4Ba and Cyt2Aa2 toxins from Bacillus thuringiensis
Issued Date
2023
Copyright Date
2016
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xv, 117 leaves : ill. (some col.)
Access Rights
restricted access
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (Ph.D. (Medical Technology))--Mahidol University, 2016
Suggested Citation
Autaipohn Kaikaew Molecular study of interactions between Cry4Ba and Cyt2Aa2 toxins from Bacillus thuringiensis. Thesis (Ph.D. (Medical Technology))--Mahidol University, 2016. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/89548
Title
Molecular study of interactions between Cry4Ba and Cyt2Aa2 toxins from Bacillus thuringiensis
Alternative Title(s)
การศึกษาเชิงโมเลกุลของปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนสารพิษ Cry4Ba และ Cyt2Aa2 จากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis
Author(s)
Abstract
The functional importance of the B2-B3 and B4-B5hairpin-loops in the receptor-binding domain of Cry4Ba toxin from Bacillus thuringiensissubsp. israelensis has been clearly identified. These two critical surface-exposed loops of Cry4Ba toxin are also involved in synergistic interactions with Cyt2Aa2 toxin from B. thuringiensis subsp. darmstadiensis. In this study, Thr328 in a2 and Thr369in a5 of the receptor-binding domain of Cry4Ba toxin were investigated for their essential roles in H-bonded stabilisation of B2-B3 and B4-B5 hairpins. Alanine substitution was employed to generate T328A-RQ and T369A-RQ mutants using Cry4Ba-RQ as a template. Bioassays revealed that these two mutants displayed a drastic decrease in toxicity against Aedesaegypti mosquito-larvae. Additionally, ELISA-based binding assays revealed a complete loss in binding of both T328A-RQ and T369A-RQ mutants to Cyt2Aa2 toxin. These results suggested that both Thr328 and Thr369 are involved in interactions between Cry4Ba and Cyt2Aa2. Moreover, structural analysis disclosed the side-chain H-bonding between Thr328 and Thr369 which is critical for stability of the B2-B3 and B4-B5hairpins of Cry4Ba. In contrast, the E417A/Y455A-RQ double-mutant, containing mutations at B6-B7 and a8-a9 loops of cry4Ba toxin, showed partial loss in toxicity against A. aegypti mosquito-larvae. In addition, E417A/Y455A-RQ still retained a high affinity for binding to Cyt2Aa2. Additionally, toxicity restoration assays revealed that in combination with Cyt2Aa2, E417A/Y455A-RQ exhibited greatly enhanced toxicity against A. aegypti larvae at a level comparable to that of the wild-type toxin. These results indicate that B6-B7 and B8-B9 loops were involved in binding to Aedes receptors, but not involved in interactions with Cyt2Aa2. Additionally, Cyt2Aa2 toxin can act as an alternative receptor for Cry4Ba. Moreover, these two toxins showed a synergistic effect on toxicity against A. aegypti mosquito larvae.
ความสำคัญเชิงหน้าที่ของ β2-β3 และ β4-β5hairpin-loops ในโดเมนจับตัวรับของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงลาย Cry4Ba จาก Bacillus thuringiensis subsp. israelensisถูกบ่งชี้อย่างชัดเจน loop ที่สำคัญยิ่งสองloop ที่ปรากฏบนผิวของโปรตีน สารพิษ Cry4Ba นี้ยังมีความเกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ที่เสริมกันกับโปรตีน สารพิษ Cyt2Aa2 จาก B. thuringiensissubsp. darmstadiensis ในการศึกษานี้ Thr328และ Thr369 ซึ่งอยู่บนสายβ2 และ β5 ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงลาย Cry4Ba ตามลำดับ ได้ถูกศึกษาถึงบทบาทที่สำคัญต่อการสร้างพันธะไฮโดรเจนที่ สำคัญต่อเสถียรภาพของ β2-β3และβ4-β5 hairpin การแทนที่ด้วยกรดอะมิโน alanine ถูกนำมาใช้เพื่อสร้างโปรตีนกลายพันธุ์ T328A-RQ และ T369A-RQ โดยใช้โปรตีน Cry4Ba-RQ เป็นต้นแบบ เมื่อทดสอบความเป็นพิษพบว่าโปรตีนกลายพันธุ์ทั้งสองตัวไม่แสดงความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงลาย Aedesaegypti นอกจากนี้การทดสอบการจับกันด้วย ELISA แสดงให้เห็นว่า โปรตีนกลายพันธุ์ T328A-RQ และ T369A-RQ ไม่สามารถจับกับโปรตีน Cyt2Aa2 ได้ ผลการทดลองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าทั้ง Thr328และ Thr369เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีน สารพิษ Cry4Ba และ Cyt2Aa2 นอกจากนี้ การวิเคราะห์โครงสร้างได้แสดงให้เห็น พันธะไฮโดรเจนระหว่างสายโซ่ข้างของ Thr328และ Thr369ซึ่งมีความสำคัญยิ่งต่อเสถียรภาพของ β2-β3 และ β4-β5hairpin ของโปรตีนสารพิษCry4Ba ในทางตรงกันข้าม โปรตีนกลายพันธุ์ E417A/Y455A-RQ ซึ่งมีการกลายพันธุ์ที่ β6-β7และ β8-β9loop แสดงการลดลงของการเกิดพิษเพียงบางส่วนต่อลูกน้ำยุงลาย A. aegypti นอกจากนี้โปรตีนกลายพันธุ์ E417A/Y455A-RQ ยังคงรักษาสัมพรรคภาพของการจับกับโปรตีน Cyt2Aa2 และการศึกษาการกู้คืนความเป็นพิษเมื่อรวมกันกับโปรตีน Cyt2Aa2 ในปริมาณที่ไม่ก่อพิษเผยให้เห็นว่าโปรตีนกลายพันธุ์ E417A/Y455A-RQ แสดงระดับการเกิดพิษที่สูงขึ้นอย่างยิ่งยวดต่อลูกน้ำยุงลาย A. aegypti ผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่าลูป β6-β7และ β8-β9มีความเกี่ยวข้องกับการจับกับโปรตีนตัวรับของ Aedesแต่ไม่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์กับโปรตีน Cyt2Aa2 นอกจากนี้แล้ว โปรตีน Cyt2Aa2 ยังเป็นตัวรับทางเลือกอีกตัวหนึ่งสำหรับโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงลาย Cry4Ba และ โปรตีนทั้งสองสามารถแสดงปรากฏการณ์การเสริมกันในการเกิดพิษต่อลูกน้ำยุงลาย A. aegypti
ความสำคัญเชิงหน้าที่ของ β2-β3 และ β4-β5hairpin-loops ในโดเมนจับตัวรับของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงลาย Cry4Ba จาก Bacillus thuringiensis subsp. israelensisถูกบ่งชี้อย่างชัดเจน loop ที่สำคัญยิ่งสองloop ที่ปรากฏบนผิวของโปรตีน สารพิษ Cry4Ba นี้ยังมีความเกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ที่เสริมกันกับโปรตีน สารพิษ Cyt2Aa2 จาก B. thuringiensissubsp. darmstadiensis ในการศึกษานี้ Thr328และ Thr369 ซึ่งอยู่บนสายβ2 และ β5 ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงลาย Cry4Ba ตามลำดับ ได้ถูกศึกษาถึงบทบาทที่สำคัญต่อการสร้างพันธะไฮโดรเจนที่ สำคัญต่อเสถียรภาพของ β2-β3และβ4-β5 hairpin การแทนที่ด้วยกรดอะมิโน alanine ถูกนำมาใช้เพื่อสร้างโปรตีนกลายพันธุ์ T328A-RQ และ T369A-RQ โดยใช้โปรตีน Cry4Ba-RQ เป็นต้นแบบ เมื่อทดสอบความเป็นพิษพบว่าโปรตีนกลายพันธุ์ทั้งสองตัวไม่แสดงความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงลาย Aedesaegypti นอกจากนี้การทดสอบการจับกันด้วย ELISA แสดงให้เห็นว่า โปรตีนกลายพันธุ์ T328A-RQ และ T369A-RQ ไม่สามารถจับกับโปรตีน Cyt2Aa2 ได้ ผลการทดลองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าทั้ง Thr328และ Thr369เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีน สารพิษ Cry4Ba และ Cyt2Aa2 นอกจากนี้ การวิเคราะห์โครงสร้างได้แสดงให้เห็น พันธะไฮโดรเจนระหว่างสายโซ่ข้างของ Thr328และ Thr369ซึ่งมีความสำคัญยิ่งต่อเสถียรภาพของ β2-β3 และ β4-β5hairpin ของโปรตีนสารพิษCry4Ba ในทางตรงกันข้าม โปรตีนกลายพันธุ์ E417A/Y455A-RQ ซึ่งมีการกลายพันธุ์ที่ β6-β7และ β8-β9loop แสดงการลดลงของการเกิดพิษเพียงบางส่วนต่อลูกน้ำยุงลาย A. aegypti นอกจากนี้โปรตีนกลายพันธุ์ E417A/Y455A-RQ ยังคงรักษาสัมพรรคภาพของการจับกับโปรตีน Cyt2Aa2 และการศึกษาการกู้คืนความเป็นพิษเมื่อรวมกันกับโปรตีน Cyt2Aa2 ในปริมาณที่ไม่ก่อพิษเผยให้เห็นว่าโปรตีนกลายพันธุ์ E417A/Y455A-RQ แสดงระดับการเกิดพิษที่สูงขึ้นอย่างยิ่งยวดต่อลูกน้ำยุงลาย A. aegypti ผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่าลูป β6-β7และ β8-β9มีความเกี่ยวข้องกับการจับกับโปรตีนตัวรับของ Aedesแต่ไม่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์กับโปรตีน Cyt2Aa2 นอกจากนี้แล้ว โปรตีน Cyt2Aa2 ยังเป็นตัวรับทางเลือกอีกตัวหนึ่งสำหรับโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงลาย Cry4Ba และ โปรตีนทั้งสองสามารถแสดงปรากฏการณ์การเสริมกันในการเกิดพิษต่อลูกน้ำยุงลาย A. aegypti
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Department
Faculty of Medical Technology
Degree Discipline
Medical Technology
Degree Grantor(s)
Mahidol University