Crystallization of 2-Methyl-3-Hydroxypyridine-5-Carboxylic acid oxygenase from soil bacterium Pseudomonas SP. MA-1

Abstract

2-Methyl-3-hydroxypyridine-5-carboxylic acid (MHPC) oxygenase (MHPCO; EC 1.14.12.4) is a flavin-containing enzyme involved in the degradation of vitamin B6 (pyridoxine) by the soil bacterium, Pseudomonas sp. MA-1. MHPCO catalyzes the conversion of its aromatic substrate, MHPC, yielding an aliphatic compound a-(N-acetylaminomethylene)-succinic acid (AAMS). The reaction occurs via hydroxylation reaction and subsequently ring-cleavage reaction. Previous studies have shown that one atom of an atmospheric oxygen molecule is incorporated into the aromatic substrate via electrophilic aromatic substitution mechanism. Another oxygen atom is derived from water molecule. In addition, a metal ion cofactor usually needed for dioxygenase enzymes, is not required in the ring cleavage reaction. Instead, only a flavin adenine dinucleotide cofactor is employed in the aromatic ring cleavage, making it a unique reaction among the group of aromatic flavoprotein hydroxylases. Therefore, availability of atomic resolution structures of MHPCO would provide key insights into the mechanism of this intriguing reaction. In this work, the microbatch and hanging-drop vapor diffusion techniques were applied to obtain crystals of MHPCO complexes: one is a binary complex with its substrate, MHPC, and the other is a flavin complex. The enzyme-substrate complex crystals were crystallized in monoclinic C2 and orthorhombic C222 space groups. The C2 crystal form contains two molecules per asymmetric unit with corresponding VM of 2.6 Å3/Da and 52.7% solvent content. The latter crystal form has four molecules per asymmetric unit with corresponding VM of 2.7 Å3/Da and 53.4% solvent content. These two crystals diffracted X-rays to resolution of 2.5 Å and 2.3 Å, respectively. In addition the flavin complex diffracted X-rays to 2.25 Å resolution. The crystal belonged to the triclinic P1 space group with four molecules per unit cell corresponding to VM of 3.2 Å3/Da and 61.2% solvent content.

2-Methyl-3-hydroxypyridine-5-carboxylic acid (MHPC) oxygenase (MHPCO) เป็นเอนไซม์ที่มี FAD (flavin adenine dinucleotide) เป็นโคเอนไซม์ และเกี่ยวข้องกับการสลายตัวของวิตามินบี 6 ที่อยู่ในดินโดยเชื้อแบคทีเรีย Pseudomonas sp. MA-1 เอนไซม์ MHPCO ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนสารตั้งต้น MHPC ซึ่งเป็นสารอะโรมาติกตัวสุดท้ายที่อยู่ในขบวนการย่อยสลายวิตามินบี 6 ให้เป็นสารอะลิฟาติก a-(N-acetylaminomethylene)-succinic acid (AAMS) โดยการเติมหมู่ไฮดรอกซิลเข้าไปในโมเลกุลซึ่งจะทำให้เกิดการสลายพันธะเคมีของสารอะโรมาติก โดยปรกติการสลาย พันธะเคมีของสารอะโรมาติกโดยเอนไซม์ในกลุ่ม dioxygenases จะต้องการไอออนของธาตุโลหะเป็นโคแฟคเตอร์ช่วยในการเกิดปฏิกิริยา แต่ในเอนไซม์นี้ต้องการเฉพาะโมเลกุลของ FAD เป็นโคแฟคเตอร์ปฏิกิริยานี้เป็นปฏิกิริยาเดียวที่พบอยู่ในกลุ่มของเอนไซม์ aromatic flavoprotein hydroxylase เพราะฉะนั้นการมีโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์จะช่วยในการเข้าใจกลไกปฏิกิริยาที่น่าสนใจนี้มากขึ้นในระดับโมเลกุล ดังนั้นการตกผลึกโดยวิธี microbatch และ hanging-drop vapor diffusion จึงถูกนำมาใช้ เพื่อนำไปสู่การหาโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ต่อไป ในการวิจัยนี้สามารถตกผลึกเชิงซ้อนของ MHPCO กับสารตั้งต้นได้สองแบบ และสามารถหักเหของแสงเอกซ์เรย์ได้ความละเอียดถึง 2.5 A และ 2.3 A โดยมีสมมาตรโมเลกุลเป็น monoclinic C2 และ orthorhombic C222 โดยที่มีโปรตีน 2 โมเลกุล และ 4 โมเลกุล ในหน่วยอสมมาตรตามลำดับ ซึ่งสอดคล้องกับค่าสัมประสิทธิ์ของ Matthews คือ 2.6 และ 2.7 A /Da และปริมาณน้ำในผลึกประมาณ 52.7% และ 53.4% ตามลำดับ สำหรับผลึกเชิงซ้อนกับ FAD สามารถตกผลึกได้และทำการวัดการหักเหของแสงเอกซ์เรย์ได้ความละเอียดถึง 2.25 A มีสมมาตรโมเลกุลเป็นแบบ triclinic P1 และมีโปรตีน 4 โมเลกุลใน 1 หน่วยเซลล์ ที่ค่าสัมประสิทธิ์ของ Matthews เท่ากับ 3.2 A3/Da และมีปริมาณน้ำในผลึกประมาณ 61.2%