Degradation of 3-chlorobenzoate by pseudomonas putida 10.2
25
Issued Date
2023
Copyright Date
1996
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xxiv, 161 leaves : ill.
Access Rights
restricted access
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (Ph.D. (Microbiology))--Mahidol University, 1996
Suggested Citation
Wimol Thangsununthum Degradation of 3-chlorobenzoate by pseudomonas putida 10.2. Thesis (Ph.D. (Microbiology))--Mahidol University, 1996. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/88402
Title
Degradation of 3-chlorobenzoate by pseudomonas putida 10.2
Alternative Title(s)
การย่อยสลาย 3-chlorobenzoate โดย pseudomonas putida 10.2
Author(s)
Abstract
By using 3CBa enrichment in batch culture technique, a bacterium with high capability in degrading 3CBa strain was isolated. This bacterium was identified as Pseudomonas putida and was designated as strain 10.2. It was found through the use of cell suspension that P. putida 10.2 could degrade 3CBa at the rate of 93.3 nmole ml(-1) hr(-1) by using 1 mg ml(-1) of cell suspension. This strain could remove 48% of 3CBa after 24 hours of incubation. When P. putida 10.2 was cultured in MM9 supplemented with 1 mM 3CBa and incubated with shaking at 30 degree C the specific growth rate (µ) and growth yield (ỵ) were found to be at 0.27 hr(-1) and 0.08 mg ml(-1), respectively. The rate of 3CBa degradation by P. putida 10.2 during the cells being grown in MM9 supplemented with 3CBa were found to be at 32.5 nmole ml(-1) hr(-1) with percentage of 3CBa utilization after 24 hr of incubation at 48.0 %. It was further found that chloride ions were released into the growth media at the rate of 16.7 nmole ml(-1) hr(-1) during the reduction of 3CBa. And it was found that the rate and percentage of 3CBa utilization by the cells being grown in MM9 supplemented with 3CBa were reduced when the isolate was grown in the presence of glucose, pyruvate, lactose, or succinate. When the resting cell suspensions were used to investigate the degradation of 3CBa, it was found that preincubation conditions were important, the cells harvested from early stationary phase showed the highest rate as well as the total amount of 3CBa degradation. The optimal temperature and pH range for 3CBa degradation by resting cell suspensions were 28to 30 degree C and 6 to 7, respectively. Preculturing conditions were also found to have effect on the 3CBa degradation by resting cell suspension. The rates of 3CBa degradation by the cell suspension which were precultured in media supplemented with glucose, lactose or succinate was found to reduced to 8.3, 13.3 and 20.3 nmole ml(-1) hr(-1) respectively. The rate of 3CBa degradation without other carbon source supplementation was at 93.3 nmole ml(-1) hr(-1) The percentage of 3CBa utilization after 24 hr incubation were also found to be reduced when cells were precultured in the presence of glucose, lactosed or succinate to the level of 5, 16, and 24 %, respectively. The percentage of reduction of 3CBa without other carbon supplementation was at 48%. Analyses of metabolites produced by P. putida 10.2 either from culture broth in presence of 3CBa or from supernatant of cell suspension containing 3CBa were identified as 3-chlorocatechol (3CC), catechol (CAT) and muconic acid (MUC). The techniques used for identification of these metabolites were colorimetric test for analysis of 3CC, HPLC for analysis of 3CC, CAT and MUC. The specific activities of 3CBa degrading enzyme in crude enzyme extract were studied and it was found to be 4.2 units mg(-1) MgSO4, CaCl2 and reduced NAD were required for the activities of 3CBa degrading enzyme in crude extract. Since 3CC was identified as one of the metabolites, studies were conducted to investigate the presence of 3CC degrading enzyme in crude extract of P. putida 10.2. The activities of enzyme were determined from the production of CAT. 3CC degrading enzyme from P. putida 10.2 was partially purified using ammonium sulphate precipitation, DEAE anion exchange and G200 sephadex gel filtration techniques. The enzyme was purified by 10.2 folds with the yield of 0.3 %. The enzyme activity in the final preparation had the specific activity at 19.3 units mg(-1) Some characteristics of 3CC degrading enzyme were studied and it was found that the molecular weight of this enzyme was approximately 65 kDa with the optimal pH of 7.0, the optimal temperature at 37 degree C and the enzyme required MgSO4 and reduced NADP for activities. The analysis of CAT produced in reactions contained 3CC and partial purified protein was confirmed by using LC/MS. The presence of catechol 1,2 dioxygenase (C120I) in the crude enzyme extract was also confirmed. This enzyme converted CAT to MUC with the specificity in the crude extract of 0.7 units mg(-1). From the studies of metabolites analysis in culture broth and presence of key enzymes involved in 3CBa degradation, the biodegradative pathway of 3CBa of P.putida 10.2 was proposed. Firstly, 3CBa was metabolized to be 3CC by the activities of benzoate dioxygenase and dihydroxy chlorobenzoated dehydrogenase. Secondly, 3CC was metabolized to be CAT by reductive dechlorination activities of 3CC degrading enzyme. Thirdly, CAT was metabolized to MUC by the activity of C 120I.
งานวิจัยนี้ประสบความสำเร็จ ในการคัดเลือกจุลินทรีย์ ที่มีความสามารถในการย่อยสลายสาร 3-chlorobenzoate (3CBa) จากตัวอย่างดินและน้ำจากแหล่งต่างๆ โดยวิธี batch culture enrichment และสามารถพบจุลินทรีย์ที่เจริญพันธุ์ โดยใช้ 3CBa เป็นแหล่งคาร์บอน ได้อย่างมีประสิทธิภาพสูง คือ สายพันธุ์ 10.2 พบว่าการย่อยสลาย 3CBa โดย cell suspension ที่มีความเข้มข้นของเชื้อเป็น 1.0 มิลลิกรัมต่อ มิลลิลิตร โดยมีอัตราการย่อยสลาย 3CBa เท่ากับ 93.3 นาโน โมลต่อมิลลิลิตร ต่อชั่วโมง และสามารถย่อยสลาย 3CBa ได้ ร้อยละ 48 หลังจากได้เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี 3CBa เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากการดำเนินการ ตรวจสอบ เพื่อบ่งชี้ชนิดของสายพันธุ์ 10.2 พบว่าเป็นบักเตรีชนิด Pseudomonas putida อัตราการเจริญพันธุ์ของ P. putida 10.2 ในอาหาร เลี้ยงเชื้อชนิด MM9 ที่มีความเข้มข้นของ 3CBa เป็น 1 มิลลิโมลาร์ เมื่อบ่มเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส โดยวางบนที่ เขย่าแสดงค่าสัมประสิทธิ์ของการเจริญพันธุ์ (µ) เป็น 0.27 ต่อชั่วโมงและมีปริมาณเชื้อ (yield) เป็น 0.08 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร อัตราการย่อยสลาย 3CBa ในขณะที่เชื้อ กำลังเจริญเติบโตมีค่า 32.5 นาโนโมลต่อมิลลิลิตรต่อชั่วโมง และมีร้อยละการย่อยสลาย 3CBa เป็น 48 พบว่ามีการเพิ่มขึ้น ของคลอไรด์อิออนในอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยอัตรา 16.7 นาโนโมล ต่อมิลลิลิตรต่อชั่วโมง ในภาวะที่มีแหล่งคาร์บอนอื่น เช่น น้ำตาลกลูโคส, น้ำตาลแลคโตส, ไพรูเวท และซัคซิเนต พบว่าอัตรา และร้อยละการย่อยสลาย 3CBa ลดลง จากการตรวจสอบความสามารถในการย่อยสลาย 3CBa โดย resting cell suspension ของ P. putida 10.2 พบว่าระยะการเจริญเติบโต (growth phase) ของเชื้อมีผลต่อ การย่อยสลาย โดยพบว่าเซลซึ่งอยู่ในระยะ early stationary แสดงอัตราและร้อยละการย่อยสลาย 3CBa หลังจากบ่มเพาะเป็น เวลา 24 ชั่วโมงได้สูงสุดและเมื่อตรวจสอบการย่อยสลาย 3CBa โดย resting cell suspension พบว่าอุณหภูมิ และค่าความ เป็นกรดด่างของ สารละลายบัพเฟอร์ ที่เหมาะสม สำหรับการย่อย สลาย 3CBa คือ อุณหภูมิ 28 ถึง 30 องศาเซลเซียส และเมื่อ อยู่ในสารละลายบัพเฟอร์ ที่มีค่าความเป็นกรดด่างเป็น 6 ถึง 7 อาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการเตรียม resting cell suspension มีผลต่อการย่อยสลาย 3CBa โดยพบว่า resting cell suspension ที่เตรียมจากเซลที่ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิด MM9 ที่มีแหล่งคาร์บอนชนิดอื่นนอกเหนือจาก 3CBa มีอัตราการย่อย สลาย 3CBa ลดลงเมื่อเทียบกับอัตราการย่อยสลาย 3CBa โดย resting cell suspension ที่เตรียมจากเซลที่ถูกเพาะเลี้ยง ในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิด MM9 ที่มีเฉพาะ 3CBa เป็นแหล่ง คาร์บอน โดยพบว่าอัตราการย่อยสลาย 3CBa นั้นลดลงจาก 93.3 เป็น 8.3, 13.3 และ 20.3 นาโนโมล ต่อมิลลิลิตร ต่อชั่วโมง สำหรับร้อยละการย่อยสลายของ 3CBa โดย resting cell suspension เหล่านี้ลดลงจาก 48 เป็น 5, 16 และ 24 หากเปรียบเทียบจากสภาวะที่ไม่มีแหล่งคาร์บอน อื่น เช่น การเติมน้ำตาลกลูโคส, น้ำตาลแลคโตส, หรือ ซัคซิเนต ตามลำดับ จากผลการดำเนินการวิเคราะห์ชนิดของ metabolites ที่เกิดขึ้นในขบวนการย่อยสลาย 3CBa โดยเชื้อ P. putida 10.2 ในน้ำเลี้ยงเชื้อที่มี 3CBa และจากสารส่วนใส (suspernatant) ของปฏิกิริยาที่มี cell suspension กับ 3CBa พบว่าเป็น 3-chlorocatechol (3CC), catechol (CAT) และ muconic acid (MUC) โดยใช้ปฏิกิริยาการเกิดสีในการทดสอบ 3CC, เทคนิค HPLC ในการทดสอบ 3CC, CAT และ MUC การตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์ที่ย่อยสลาย 3CBa ใน crude enzyme extract พบว่ามีค่าเป็น 4.2 หน่วยต่อมิลลิกรัม นอกจากนี้ยังพบว่าการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ย่อยสลาย 3CBa ต้องการ MgSo4, CaCl2 และ reduced NAD ดำเนินการตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์ชนิด 3CC degrading enzyme ใน crude extract โดยการตรวจวัด ปริมาณ CAT ที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยาและดำเนินการแยกเอนไซม์ให้ บริสุทธิ์บางส่วนโดยวิธีตกตะกอนโปรตีนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต, DEAE sephadex A50 anion exchange และ gel filtration ชนิด sephadex G200 พบว่า ค่ากิจกรรมเฉพาะของเอนไซม์ที่ แยกหลังจากผ่าน gel filtration ชนิด sephadex G200 มี ค่าเป็น 19.3 หน่วยต่อมิลลิกรัม โดยมีปริมาณโปรตีน (yield) ร้อยละ 0.3 และมีค่าความบริสุทธิ์เป็น 10.2 เท่า จากการศึกษา โปรตีนที่บริสุทธิ์ พบว่าเอนไซม์ชนิด 3CC degrading enzyme มี น้ำหนักโมเลกุลประมาณ 65 กิโลดาลตัน โดยจะแสดงค่ากิจกรรม เฉพาะสูงสุด เมื่ออยู่ในสารละลายบัพเฟอร์ที่มีค่าความเป็นกรด ด่างที่ 7.0, ทำปฏิกิริยาที่ 37 องศาเซลเซียสและต้องการ MgSO4 และ reduced NADP สำหรับการเกิดปฏิกิริยา นอกจากนี้ จากการตรวจสอบเพื่อชี้บ่งชนิดของสารผลิตภัณฑ์ ที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยาของ 3CC degrading enzyme เมื่อ เติม 3CC เป็นสารตั้งต้น ด้วยวิธี liquid chromatography/ mass spectrometry พบว่าเป็น CAT จากการตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์ชนิด catechol 1,2-dioxygenase (C120I) ใน crude extract โดยใช้ CAT เป็นสารตั้งต้น และตรวจวัดปริมาณของ MUC ซึ่งเป็นสาร ผลิตภัณฑ์ด้วยวิธี high pressure liquid chromatography พบว่าเอนไซม์ C120I มีค่ากิจกรรมเฉพาะเป็น 0.7 หน่วยต่อ มิลลิกรัม จากการวิเคราะห์สารที่เกิดขึ้นในน้ำเลี้ยงเชื้อและการ ศึกษากิจกรรมของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องในขบวนการย่อยสลาย 3CBa โดย P. putida 10.2 คาดว่าขบวนการย่อยสลาย 3CBa โดย P. putida 10.2 น่าเริ่มจากการที่ 3CBa ถูกย่อย เป็น 3CC โดยเอนไซม์ชนิด benzoate dioxygenase และ dihydroxy chlorobenzoate dehydrogenase และ 3CC ถูกย่อยเป็น CAT ด้วยปฏิกิริยา reductive dechlorination โดยเอนไซม์ 3CC degrading enzyme จากนั้น CAT จะถูกย่อย ต่อไปเป็น MUC ด้วยเอนไซม์ C120I ตามลำดับ
งานวิจัยนี้ประสบความสำเร็จ ในการคัดเลือกจุลินทรีย์ ที่มีความสามารถในการย่อยสลายสาร 3-chlorobenzoate (3CBa) จากตัวอย่างดินและน้ำจากแหล่งต่างๆ โดยวิธี batch culture enrichment และสามารถพบจุลินทรีย์ที่เจริญพันธุ์ โดยใช้ 3CBa เป็นแหล่งคาร์บอน ได้อย่างมีประสิทธิภาพสูง คือ สายพันธุ์ 10.2 พบว่าการย่อยสลาย 3CBa โดย cell suspension ที่มีความเข้มข้นของเชื้อเป็น 1.0 มิลลิกรัมต่อ มิลลิลิตร โดยมีอัตราการย่อยสลาย 3CBa เท่ากับ 93.3 นาโน โมลต่อมิลลิลิตร ต่อชั่วโมง และสามารถย่อยสลาย 3CBa ได้ ร้อยละ 48 หลังจากได้เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี 3CBa เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากการดำเนินการ ตรวจสอบ เพื่อบ่งชี้ชนิดของสายพันธุ์ 10.2 พบว่าเป็นบักเตรีชนิด Pseudomonas putida อัตราการเจริญพันธุ์ของ P. putida 10.2 ในอาหาร เลี้ยงเชื้อชนิด MM9 ที่มีความเข้มข้นของ 3CBa เป็น 1 มิลลิโมลาร์ เมื่อบ่มเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส โดยวางบนที่ เขย่าแสดงค่าสัมประสิทธิ์ของการเจริญพันธุ์ (µ) เป็น 0.27 ต่อชั่วโมงและมีปริมาณเชื้อ (yield) เป็น 0.08 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร อัตราการย่อยสลาย 3CBa ในขณะที่เชื้อ กำลังเจริญเติบโตมีค่า 32.5 นาโนโมลต่อมิลลิลิตรต่อชั่วโมง และมีร้อยละการย่อยสลาย 3CBa เป็น 48 พบว่ามีการเพิ่มขึ้น ของคลอไรด์อิออนในอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยอัตรา 16.7 นาโนโมล ต่อมิลลิลิตรต่อชั่วโมง ในภาวะที่มีแหล่งคาร์บอนอื่น เช่น น้ำตาลกลูโคส, น้ำตาลแลคโตส, ไพรูเวท และซัคซิเนต พบว่าอัตรา และร้อยละการย่อยสลาย 3CBa ลดลง จากการตรวจสอบความสามารถในการย่อยสลาย 3CBa โดย resting cell suspension ของ P. putida 10.2 พบว่าระยะการเจริญเติบโต (growth phase) ของเชื้อมีผลต่อ การย่อยสลาย โดยพบว่าเซลซึ่งอยู่ในระยะ early stationary แสดงอัตราและร้อยละการย่อยสลาย 3CBa หลังจากบ่มเพาะเป็น เวลา 24 ชั่วโมงได้สูงสุดและเมื่อตรวจสอบการย่อยสลาย 3CBa โดย resting cell suspension พบว่าอุณหภูมิ และค่าความ เป็นกรดด่างของ สารละลายบัพเฟอร์ ที่เหมาะสม สำหรับการย่อย สลาย 3CBa คือ อุณหภูมิ 28 ถึง 30 องศาเซลเซียส และเมื่อ อยู่ในสารละลายบัพเฟอร์ ที่มีค่าความเป็นกรดด่างเป็น 6 ถึง 7 อาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการเตรียม resting cell suspension มีผลต่อการย่อยสลาย 3CBa โดยพบว่า resting cell suspension ที่เตรียมจากเซลที่ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิด MM9 ที่มีแหล่งคาร์บอนชนิดอื่นนอกเหนือจาก 3CBa มีอัตราการย่อย สลาย 3CBa ลดลงเมื่อเทียบกับอัตราการย่อยสลาย 3CBa โดย resting cell suspension ที่เตรียมจากเซลที่ถูกเพาะเลี้ยง ในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิด MM9 ที่มีเฉพาะ 3CBa เป็นแหล่ง คาร์บอน โดยพบว่าอัตราการย่อยสลาย 3CBa นั้นลดลงจาก 93.3 เป็น 8.3, 13.3 และ 20.3 นาโนโมล ต่อมิลลิลิตร ต่อชั่วโมง สำหรับร้อยละการย่อยสลายของ 3CBa โดย resting cell suspension เหล่านี้ลดลงจาก 48 เป็น 5, 16 และ 24 หากเปรียบเทียบจากสภาวะที่ไม่มีแหล่งคาร์บอน อื่น เช่น การเติมน้ำตาลกลูโคส, น้ำตาลแลคโตส, หรือ ซัคซิเนต ตามลำดับ จากผลการดำเนินการวิเคราะห์ชนิดของ metabolites ที่เกิดขึ้นในขบวนการย่อยสลาย 3CBa โดยเชื้อ P. putida 10.2 ในน้ำเลี้ยงเชื้อที่มี 3CBa และจากสารส่วนใส (suspernatant) ของปฏิกิริยาที่มี cell suspension กับ 3CBa พบว่าเป็น 3-chlorocatechol (3CC), catechol (CAT) และ muconic acid (MUC) โดยใช้ปฏิกิริยาการเกิดสีในการทดสอบ 3CC, เทคนิค HPLC ในการทดสอบ 3CC, CAT และ MUC การตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์ที่ย่อยสลาย 3CBa ใน crude enzyme extract พบว่ามีค่าเป็น 4.2 หน่วยต่อมิลลิกรัม นอกจากนี้ยังพบว่าการเกิดปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ย่อยสลาย 3CBa ต้องการ MgSo4, CaCl2 และ reduced NAD ดำเนินการตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์ชนิด 3CC degrading enzyme ใน crude extract โดยการตรวจวัด ปริมาณ CAT ที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยาและดำเนินการแยกเอนไซม์ให้ บริสุทธิ์บางส่วนโดยวิธีตกตะกอนโปรตีนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต, DEAE sephadex A50 anion exchange และ gel filtration ชนิด sephadex G200 พบว่า ค่ากิจกรรมเฉพาะของเอนไซม์ที่ แยกหลังจากผ่าน gel filtration ชนิด sephadex G200 มี ค่าเป็น 19.3 หน่วยต่อมิลลิกรัม โดยมีปริมาณโปรตีน (yield) ร้อยละ 0.3 และมีค่าความบริสุทธิ์เป็น 10.2 เท่า จากการศึกษา โปรตีนที่บริสุทธิ์ พบว่าเอนไซม์ชนิด 3CC degrading enzyme มี น้ำหนักโมเลกุลประมาณ 65 กิโลดาลตัน โดยจะแสดงค่ากิจกรรม เฉพาะสูงสุด เมื่ออยู่ในสารละลายบัพเฟอร์ที่มีค่าความเป็นกรด ด่างที่ 7.0, ทำปฏิกิริยาที่ 37 องศาเซลเซียสและต้องการ MgSO4 และ reduced NADP สำหรับการเกิดปฏิกิริยา นอกจากนี้ จากการตรวจสอบเพื่อชี้บ่งชนิดของสารผลิตภัณฑ์ ที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยาของ 3CC degrading enzyme เมื่อ เติม 3CC เป็นสารตั้งต้น ด้วยวิธี liquid chromatography/ mass spectrometry พบว่าเป็น CAT จากการตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์ชนิด catechol 1,2-dioxygenase (C120I) ใน crude extract โดยใช้ CAT เป็นสารตั้งต้น และตรวจวัดปริมาณของ MUC ซึ่งเป็นสาร ผลิตภัณฑ์ด้วยวิธี high pressure liquid chromatography พบว่าเอนไซม์ C120I มีค่ากิจกรรมเฉพาะเป็น 0.7 หน่วยต่อ มิลลิกรัม จากการวิเคราะห์สารที่เกิดขึ้นในน้ำเลี้ยงเชื้อและการ ศึกษากิจกรรมของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องในขบวนการย่อยสลาย 3CBa โดย P. putida 10.2 คาดว่าขบวนการย่อยสลาย 3CBa โดย P. putida 10.2 น่าเริ่มจากการที่ 3CBa ถูกย่อย เป็น 3CC โดยเอนไซม์ชนิด benzoate dioxygenase และ dihydroxy chlorobenzoate dehydrogenase และ 3CC ถูกย่อยเป็น CAT ด้วยปฏิกิริยา reductive dechlorination โดยเอนไซม์ 3CC degrading enzyme จากนั้น CAT จะถูกย่อย ต่อไปเป็น MUC ด้วยเอนไซม์ C120I ตามลำดับ
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Microbiology
Degree Grantor(s)
Mahidol University