Screening, purification and characterization of a thermophile lipase
1
Issued Date
2024
Copyright Date
1995
Resource Type
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xiv, 188 leaves : ill.
Access Rights
open access
Rights
ผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้า
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 1995
Suggested Citation
Amonlaya Jaturapat Screening, purification and characterization of a thermophile lipase. Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 1995. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/100872
Title
Screening, purification and characterization of a thermophile lipase
Alternative Title(s)
การแยกการทำให้บริสุทธิ์และการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ไลเปสจากเชื้อจุลินทรีย์ทนความร้อน
Author(s)
Advisor(s)
Abstract
Thermophilic microorganisms producing lipase were screened from hot springs in northern Thailand. Seven strains exhibiting lipase activity were isolated. Among these, the strain TP404 produced the highest lipase activity (55 unit/liter culture medium) and was chosen for further study. The crude lipase had an optimum temperature at 60 degree C, pH stability 7-10 and was relatively thermostable since 80% of initial activity remained after 24 hr at 60 degree C. Purification of the thermostable lipase was performed on the enzyme produced by E.coli cloned lipase gene of TP404 (pUCTL4). The enzyme was purified to homogeneity as judged by SDS-PAGE and isoelectric focusing. The purification included ammonium sulfate fractionation and sequential column chromatographies on DEAE-Sephadex A-25, Sephadex G-100 and phenyl Sepharose CL4B. The purified enzyme was found to be a monomeric protein with molecular weight of 43 kDa by SDS-PAGE and 40 kDa by gel filtration. The optimum temperature was at 60 degree C when p-nitrophenylpalmitate was used as substrate. The pH and temperature stabilities were similar to those of native TP404. The enzyme was activated by Ca(2+) but was inhibited by various cations including Zn(2+) and Fe(2+). The enzyme was deactivated in the presence of organic solvents, among those tested, acetonitrile and acetone showed markedly effect. In the presence of low concentration of detergents (0.1-0.5%), CHAPS, Triton X-100 and Brij W-1 had the stimulatory effect whereas AOT, DOC and SDS showed inhibitory effect. The enzyme showed high lipolytic activity toward trimyristin and trilinolein and preferentially hydrolyzed ester bond of 1- and 3-position of triolein. In the form of immobilized enzyme on celite, the lipase was able to catalyze transesterification of trimyristin and soybean oil in organic solvent system. As judged from its properties, this lipase would be useful for biotechnological application.
ได้ทำการแยกเชื้อจุลินทรีย์ทนความร้อนที่ผลิต ไลเปสจากน้ำพุร้อนในภาคเหนือของประเทศไทย ได้รวม ทั้งสิ้น 7 สายพันธุ์ สายพันธุ์ที่ผลิตไลเปสสูงสุด (55 หน่วย/ลิตร) คือ TP404 ซึ่งสร้างไลเปสที่ทนความ ร้อนและทำงานได้ดีที่อุณหภูมิ 60 เซลเซียส และทนต่อความ เป็นกรดด่างในช่วง pH7-10. เนื่องจาก TP404 สร้างไลเปสในปริมาณที่ไม่สูงนัก การแยกไลเปสให้บริสุทธิ์จึงจำเป็นต้องใช้เอนไซม์ที่สร้าง โดย E.coli ที่ได้มีการโคลนยีนไลเปสจาก TP404 เข้าไป (E.coli pUCTL4) ขั้นตอนของการทำให้บริสุทธิ์ประกอบด้วย การตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต และ การแยกโดยเทคนิค คอลัมน์โครมาโตกราฟีโดยใช้ DEAE-Sephadex A-25, Sephadex G-100 และ Phenyl Sepharose CL4B ตามลำดับ ไลเปสที่เตรียมได้ประกอบด้วยโปรตีนเพียงชนิดเดียว ทั้งนี้ โดยการตรวจสอบโดยวิธีอีเลคโตรโฟรีซีส (SDS-PAGE) และ ไอโซอีเลกตริกโฟคัสซิ่ง มีน้ำหนักโมเลกุลระหว่าง 40-43 กิโลดาลตัน เมื่อหาโดยวิธี SDS-PAGE และ Sephadex G-100 column ไลเปสที่เตรียมจาก E.coli pUCTL4 มีคุณสมบัติคล้าย คลึงกับไลเปสจาก TP404 ในด้านการทนความร้อนและการทนต่อ ความเป็นกรด-ด่าง เมื่อได้ศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ พบว่า ถูกกระตุ้นได้โดย Ca(2+) และถูกยับยั้งได้โดย Zn(2+) และ Fe(2+) ในสภาวะที่มีตัวทำละลายอินทรีย์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง acetone และ acetonitrile (20-80%) เอนไซม์จะมี activity ลดลง เมื่อได้ทดสอบคุณสมบัติกับสารดีเทอร์เจ้นท์ ในปริมาณระหว่าง (0.1-5%) พบว่า CHAPS, Triton X-100 และ Brij W-1 กระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ได้ดีขึ้น ในขณะ ที่ AOT, DOC และ SDS ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ ในด้าน ความจำเพาะต่อสับสเตรท ไลเปส จาก E.coli pUCTL4 สลายไตรกลีเซอไรด์ที่มีกรดไขมันขนาดกลาง (C(,12)-C(,14)) และกรดไขมันไม่อิ่มตัว (C(,18:1),-C(,18:2)) ได้ดีกว่า กรดไขมันอิ่มตัวขนาดใหญ่ (C(,16)-C(,20)) และสามารถตัด พันธะเอสเตอร์ที่ตำแหน่ง 1- และ 3- ได้ดีกว่าที่ตำแหน่ง 2- เมื่อนำเอนไซม์มาตรึงบน celite พบว่าสามารถเร่งปฏิกิริยา Transesterification ในเฮกเซนได้ จากคุณสมบัติดังกล่าว ข้างต้น ไลเปสที่เตรียมได้สามารถจะนำไปใช้ประโยชน์ทาง ด้านเทคโนโลยีชีวภาพได้เป็นอย่างดี
ได้ทำการแยกเชื้อจุลินทรีย์ทนความร้อนที่ผลิต ไลเปสจากน้ำพุร้อนในภาคเหนือของประเทศไทย ได้รวม ทั้งสิ้น 7 สายพันธุ์ สายพันธุ์ที่ผลิตไลเปสสูงสุด (55 หน่วย/ลิตร) คือ TP404 ซึ่งสร้างไลเปสที่ทนความ ร้อนและทำงานได้ดีที่อุณหภูมิ 60 เซลเซียส และทนต่อความ เป็นกรดด่างในช่วง pH7-10. เนื่องจาก TP404 สร้างไลเปสในปริมาณที่ไม่สูงนัก การแยกไลเปสให้บริสุทธิ์จึงจำเป็นต้องใช้เอนไซม์ที่สร้าง โดย E.coli ที่ได้มีการโคลนยีนไลเปสจาก TP404 เข้าไป (E.coli pUCTL4) ขั้นตอนของการทำให้บริสุทธิ์ประกอบด้วย การตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต และ การแยกโดยเทคนิค คอลัมน์โครมาโตกราฟีโดยใช้ DEAE-Sephadex A-25, Sephadex G-100 และ Phenyl Sepharose CL4B ตามลำดับ ไลเปสที่เตรียมได้ประกอบด้วยโปรตีนเพียงชนิดเดียว ทั้งนี้ โดยการตรวจสอบโดยวิธีอีเลคโตรโฟรีซีส (SDS-PAGE) และ ไอโซอีเลกตริกโฟคัสซิ่ง มีน้ำหนักโมเลกุลระหว่าง 40-43 กิโลดาลตัน เมื่อหาโดยวิธี SDS-PAGE และ Sephadex G-100 column ไลเปสที่เตรียมจาก E.coli pUCTL4 มีคุณสมบัติคล้าย คลึงกับไลเปสจาก TP404 ในด้านการทนความร้อนและการทนต่อ ความเป็นกรด-ด่าง เมื่อได้ศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ พบว่า ถูกกระตุ้นได้โดย Ca(2+) และถูกยับยั้งได้โดย Zn(2+) และ Fe(2+) ในสภาวะที่มีตัวทำละลายอินทรีย์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง acetone และ acetonitrile (20-80%) เอนไซม์จะมี activity ลดลง เมื่อได้ทดสอบคุณสมบัติกับสารดีเทอร์เจ้นท์ ในปริมาณระหว่าง (0.1-5%) พบว่า CHAPS, Triton X-100 และ Brij W-1 กระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ได้ดีขึ้น ในขณะ ที่ AOT, DOC และ SDS ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ ในด้าน ความจำเพาะต่อสับสเตรท ไลเปส จาก E.coli pUCTL4 สลายไตรกลีเซอไรด์ที่มีกรดไขมันขนาดกลาง (C(,12)-C(,14)) และกรดไขมันไม่อิ่มตัว (C(,18:1),-C(,18:2)) ได้ดีกว่า กรดไขมันอิ่มตัวขนาดใหญ่ (C(,16)-C(,20)) และสามารถตัด พันธะเอสเตอร์ที่ตำแหน่ง 1- และ 3- ได้ดีกว่าที่ตำแหน่ง 2- เมื่อนำเอนไซม์มาตรึงบน celite พบว่าสามารถเร่งปฏิกิริยา Transesterification ในเฮกเซนได้ จากคุณสมบัติดังกล่าว ข้างต้น ไลเปสที่เตรียมได้สามารถจะนำไปใช้ประโยชน์ทาง ด้านเทคโนโลยีชีวภาพได้เป็นอย่างดี
Description
Biochemistry (Mahidol University 1995)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Biochemistry
Degree Grantor(s)
Mahidol University