Cloning and sequencing of hepatitis B virus genome adr subtype isolated in Thailand

Abstract

Hepatitis B virus (HBV) DNA from Dane particle of adr subtype isolated from blood specimens donated to the Thai Red Cross was cloned into BamHI site of plasmid pBS (+SK). The recombinant plasmid was transformed into E. coli XL- 1B. Restriction endonuclease analysis showed that the cloned HBV did not have BssH1I, EcoRI, NotI, PvuII and SacI sites but has vIpaI, BamHI, Bg/II, HpaI, KpnI, SacII, SphI, XbaI and XhoI sites, which some positions are different from others adr subtypes. Its complete nucleotide sequence was determined. The 3,215 bp sequences show the presence of 4 open reading frames (ORF) for PreS+HBsAg (174+226 amino acids), P (843 amino acids), HBcAg (212 amino acids) and X (154 amino acids). The gene locus organization was not different from those of the other adr clones so far reported. It was found that all of the direct repeat of the undecanucleotide sequence (DR1) near the 5 ends of the short (S) and long (L) strands of HBV DNA and the two small direct repeat sequences (DR2 and DR3) between both 5 ends were characteristic structures of HBV. The deduced amino acid sequences of HBsAg was analyzed in detail. The 9 amino acids of antigenic determinant a, 139CTKPSDGNC- 147, of this clone were found to be conserved. Furthermore, Cys- 124, Cys- 147 and Pro- 142 required for full antigenecity were also observed. The protein possesed Lys-122 (d) and Arg-160 (r) which were charac-teristic of adr subtype. Based on the deduced amino acid comparison in HBsAg, the genotype of cloned HBV was classified as group C. The presence of Val-177 and Pro-178 in HL,sAg indicated that the clone HBV had q subtype determinant. Furthermore, the amino acid sequence which was proposed to be the immunodeterminant of Pre-S2 region, at position 1 3 1 LLDPRVRGLYFPAG-144, and position 162-SSIFSRT-168, were found. Regarding to the conservation of amino acids defined in HBsAg and Pre-S region and some amino acids which are different from others adr subtype, the clone HBV adr subtype in this study would be suitable to use as a source of HBsAg for the production of recombinant vaccine for Thai population in the future.

ดีเอ็นเอของไวรัสตับอักเสบ บี จาก Dane particle ซึ่งพบในเลือดของผู้ที่บริจาคให้แก่สภากาชาดไทย ได้ถูกโคลนเข้าดีเอ็นเอพาหะ pBS (+SK) ที่ตำแหน่งเอนไซม์ ตัดจำเพาะ BamHI ดีเอ็นเอสายผสมที่ได้ถูกนำไป transform เข้าสู่แบคทีเรีย E. coli สายพันธุ์ XL-1B จากการ วิเคราะห์ดีเอ็นเอสายผสมโดยการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ พบว่า เอนไซม์ BssHII, EcoRI, NotI, PvuII, SacI ไม่สามารถตัดดีเอ็นเอของไวรัสตับอักเสบ บี ได้ แต่ Apal, BamHI, BglII, HpaI, KpnI, SacII, SphI, XbaI และ XhoI สามารถตัดได้ โดยมีบางตำแหน่งซึ่งแตกต่างจากสายพันธ์ adr ที่เคยมีผู้รายงานไว้ จากการวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์ซึ่งมี 3,215 bp พบว่าประกอบด้วย 4 open reading frames ได้แก่ 1) Pre-S และ HBsAg มีกรดอะมิโน 174 ตัว และ 226 ตัว ตามลำดับ 2) P มีกรดอะมิโน 843 ตัว 3) HBcAg มีกรดอะมิโน 212 ตัว และ 4) X มีกระอะมิโน 154 ตัว นอกจากนี้ยังพบว่า การจัด เรียงตัวของยีนมีความคล้ายคลึงกับไวรัสตับอักเสบ บี สายพันธุ์ adr ที่มีผู้รายงานไว้แล้ว ในดีเอ็นเอของไวรัส พบว่ามี direct repeat sequence ขนาด 11 นิวคลีโอไทด์ (DRI) ใกล้ปลายด้าน 5 ของทั้งสายสั้น (S) และสายยาว (L) และ direct repeat sequence ขนาดเล็ก (DR2 และ DR3) ระหว่างหลาย 5 ของทั้ง 2 สาย ที่เป็นคุณสมบัติเฉพาะของ ไวรัสชนิดนี้ จากการเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของ HBsAg ซึ่ง ถอดรหัสมาจากลำดับนิวคลีโอไทด์ พบว่า 1) บริเวณที่เป็น antigen determinant a อันประกอบด้วยกรดอะมิโน 9 ตัว ที่ตำแหน่ง 139 ถึง 147 ได้แก่ cystein, threonine, lysine, proline, seine, aspartic acid, glycine, asparagine, cystein, ตามลำดับ เป็นบริเวณที่ conserved สำหรับไวรัสตับอักเสบ บี ทุกสายพันธุ์ 2) มี cystein ที่ตำแหน่ง 124 และ 147 และ proline ที่ตำแหน่ง 122 (d) และ arginine ที่ตำแหน่ง 160 (r) ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของ adr subtype 4) มีกรดอะมิโนที่เป็นลักษณะเฉพาะของ genotype C และ 5) มีกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 177 เป็น valine และ 178 เป็น proline ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของ q subtype determinant นอกจากนี้เมื่อวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนของ Pre-S2 พบกรดอะมิโน ซึ่งมีผู้เสนอว่าเป็น immunodeter-minant ระหว่างตำแหน่ง 131-144 อันประกอบด้วย leucine, aspartic acid, proline, arginne, valine, arginine, glycine, leucine, tyrosine, phenylalanine, proline, alanine, glycine และระหว่างตำแหน่ง 162-168 อันประกอบด้วย serine, serine, isoleucine, phenylalanine, serine, arginine, theronine จากการที่พบว่าโคลนไวรัสตับอักเสบ บี ที่ศึกษามี โปรตีน HBsAg และ Pre-S2 ที่มีกรดอะมิโนที่สำคัญสำหรับ การทำให้เกิด antigenicity ที่สมบูรณ์ ถึงแม้ว่าจะมีกรด อะมิโนบางตำแหน่งที่แตกต่างออกไปบ้าง ดังนั้นโคลนนี้จึง น่าจะเหมาะสมที่จะนำไปสร้างโปรตีนส่วนผิวเพื่อการผลิต รีคอมบิแนนท์วัคซีน สำหรับประชากรไทยในอนาคต