Development of simple method for detection of steviol glycosides content from stevia leaf

Abstract

In this study, enzymatic assay of stevioside content in Stevia samples was developed. Recombinant BT_3567 gene was cloned from genomic DNA of anaerobic bacterium namely Bacteroides thetaiotaomicron HB-13 into pEt28a expression vector. Recombinant BT_3567 enzyme hydrolyses glucose moiety from stevioside at the position of C-13. Following with enzyme assay of glucose allowed stevioside quantitation. The steps of enzymatic stevioside determination are follows: 1) Incubate recombinant BT_3567 with Stevia sample in sodium acetate buffer, pH 6.0 at 37 °C for 10-20 min. 2) Stop reaction by heating at 80 °C for 5 min. 3) Measure glucose content using glucose oxidase and peroxidase assay. The molar amount of detected glucose was calculated as molar amount of stevioside presented in Stevia samples. Enzymatic assay developed in this study was validated and it exhibited high accuracy and precision as well as selectivity for stevioside determination in both of crude Stevia extract sample and the finished products of Stevia

ในการศึกษาครั้งนี้ทำการพํฒนาวิธีการใช้เอนไซม์ในการตรวจวัดปริมาณสตีวิโอไซด์ในตัวอย่างหญ้าหวาน โดยเริ่มจากโคลนนิ่งยีนลูกผสมบีที 3567 จากดีเอ็นเอของแบคทรีเรีย กลุ่มที่ไม่อาศัยออกซิเจนในการหายใจที่มีชื่อเรียกวา่ Bacteroides thetaiotaomicron HB-13 เข้าสู่พาหะนำยีน pET28a เอนไซม์ลูกผสมบีที 3567 สลายโมเลกุลกลูโคสตรงตำแหน่งคาร์บอนที่ 13 ของสตีวิโอไซด์ เมื่อทำการตรวจวัดกลูโคสหลังจากขั้นตอนนี้จะสามารถวัด ปริมาณสตีวิโอไซด์ที่เกิดขึ้นได้ วิธีการใช้เอนไซม์ในการตรวจวัดปริมาณสตีวิโอไซด์มีขั้นตอนดังนี้ 1) บ่มเอนไซม์ลูกผสมบีที 3567 กับตัวอย่างหญ้าหวานในโซเดียมอะซิเตทบัฟเฟอร์ พีเอช 6.0 ในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10-20 นาที 2) หยุดปฏิกิริยาโดยการให้ความร้อน 80 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที 3) วัดกลูโคสที่เกิดขึ้นโดยใช้วิธีการเอนไซม์ที่เรียกว่า กลูโคสออกซิเดสและเปอร์ออกซิเดส จำนวนโมลของสตีวิโอไซด์ที่วัดได้ในตัวอย่างหญ้าหวาน คำนวณได้จากจำนวนโมลของกลูโคสที่ตรวจวัดได้ในตัวอย่างนั้น วิธีการเอนไซม์ที่พัมนาขึ้นในการศึกษาครั้งนี้ถูกตรวจสอบแล้วว่ามีความถูกต้องและแม่นยำสูง รวมถึงมีความจำเพาะต่อการตรวจวัดปริมาณ ปริมาณสตีวิโอไซด์ทั้งในตัวอย่างสารสกัดหญ้าหวาน และผลิตภัณฑ์หญ้าหวาน