Purification and property of swamp buffalo pituitary luteinizing hormone

Abstract

In this experiment, 500 g of fresh frozen swamp buffalo anterior pituitaries of unidentified sex and age were used for luteinizing hormone (LH) purification by water extraction, (NH(,4)(,2)SO(,4) precipitation, ethanol precipitation, cation exchange chromatography (CM column) and anion exchange chromatography (DE column). It was found that the optimal range of (NH(,4)(,2)S0(,4) concentration for swamp buffalo LH (buLH) precipitation was 35 - 55% saturation. The optimal ethanol concentration for buLH precipitation was 50% (v/v). For the cation exchange chromatography, it was found that a CM column equilibrated with 0.005 M citrate buffer pH 5.5 was suitable for buLH purification and buLH could be eluted with 0.10 M citrate buffer, pH 5.5. Concerning the anion exchange chromatography, it was found that a DE column equilibrated with 0.005 M phosphate buffer pH 7.5 was suitable for buLH purification and buLH could be easily eluted with 0.05 M phosphate buffer pH 7.5. From 500 g of frozen swamp buffalo anterior pituitaries, 26 mg of partially purified buLH was obtained and the LH bioactivity was found to be 2.72 U/mg.

ต่อมใต้สมองส่วนหน้าของกระบือปลักน้ำหนักรวม 500 กรัม นำมาสกัดฮอร์โมนกระตุ้นการตกไข่ของกระบือปลัก (buLH) ให้ บริสุทธิ์ โดยใช้วิธีการสกัดด้วยน้ำ การตกตะกอนด้วยแอมโมเนียม ซัลเฟต ((NH(,4))(,2)SO(,4)) การตกตะกอนด้วยเอธานอล (ethanol) การแยกสกัดฮอร์โมนด้วย แคตอิออน เอ็กซ์เชนจ์ โครมาโตกราฟฟี่ (cation exchange chromatography : CM column) และการแยกสกัดฮอร์โมนด้วย แอนอิออน เอ็กซ์เชนจ์ โครมาโตกราฟฟี่ (anion exchange chromatography : DE column) ตามลำดับ พบว่าจากการทดสอบเบื้องต้น สารละลาย อิ่มตัวแอมโมเนียมซัลเฟตที่ใช้ในการตกตะกอน มีช่วงความเข้มข้น ที่เหมาะสมคือ 35-55% ความเข้มข้นที่เหมาะสมของเอธานอล สำหรับการตกตะกอนคือ 50% ปริมาตรต่อปริมาตร การแยกสกัด ฮอร์โมนด้วยแคตอิออน เอ็กซ์เชนจ์ โครมาโตกราฟฟี่นั้น พบว่า CM คอลัมน์ pH 5.5 เหมาะสมสำหรับการยึดจับฮอร์โมนกระตุ้น การตกไข่ของกระบือปลัก และพบว่าฮอร์โมนนี้ถูกขับออกจากคอลัมน์ ได้ด้วยสารละลายซิเตรตบัฟเฟอร์ ความเข้มข้น 0.1 โมลาร์ ที่ pH 5.5 ส่วนการแยกสกัดฮอร์โมนด้วยแอนอิออน เอ็กซ์เชนจ์ โครมาโตกราฟฟี่นั้น พบว่า DE คอลัมน์ pH 7.5 เหมาะสม สำหรับการยึดจับฮอร์โมนนี้ buLH ดังกล่าวถูกขับออกจากคอลัมน์ ได้ด้วยสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ความเข้มข้น 0.05 โมลาร์ ที่ pH 7.5 จากผลการทดลองพบว่า จากต่อมใต้สมองส่วนหน้าของ กระบือปลักน้ำหนักรวม 500 กรัม เมื่อทำการสกัดบริสุทธิ์ทุก ขั้นตอนแล้ว ได้ฮอร์โมนกระตุ้นการตกไข่ของกระบือปลักซึ่ง ยังไม่บริสุทธิ์มากนักมีน้ำหนักเท่ากับ 26 มิลลิกรัม และพบว่า มีฤทธิ์ทางชีวภาพ (LH bioactivity) เท่ากับ 2.72 หน่วย ต่อมิลลิกรัม