Purification and characterization of cephalosporin acetyl asterase

Abstract

Cephalosporin acetylesterase hydrolyzes cephalosporins at 3-position. Deacetylcephalosporins obtained are valuable intermediates in semisynthetic cephalosporin production. Many modifications can be made at the 3-position by nucleophilic displacement of the acetate group to yield compounds with improved biological activity. Cephalosporin acetylesterase was recovered from the supernatant of a B. subtilis WRRL-B-558 culture. Purification of the enzyme was achieved by procedures involving heat denaturation, ultrafiltration and column chromatographies on Q-sepharose Fast Flow, Sephadex G-200 and Phenyl Sepharose CL-4B. The procedures resulted in 21.5 fold of purification and 14 % recovery of the enzyme activity. The purified enzyme was homogeneous on polyacrylamide gel electrophoresis as indicated by both silver staining and esterase activity staining. The molecular weight of the esterase was estimated to be 130 kDa by gel filtration. Subunit determination of the purified enzyme by SDS-PAGE showed that it composed of 4 identical subunits with a molecular weight about 32 kDa.The enzyme had a temperature optimum at 50 degree C and a pH optimum of 7.5. It was highly stable in the pH range of 5.0 to 11.0 and retained full activity at 60 degree C for at least 2 hours. The Michaelis-Menten constant (Km) and Vmax for α-naphthyl acetate were 5.97 mM and 1.47 µmol/min/ml, respectively. The enzyme was sensitive to Fe3+ and Zn2+. Since the enzyme was markedly affected by PMSF and 2-mercaptoethanol, the enzyme was probably a serine esterase with at least one disulfide bridge. Analysis of reaction mixtures prepared by incubation of the enzyme solution and cephalosporin C and 7-ACA using TLC and HPLC showed that cephalosporin acetylesterase from B. subtilis WRRL-B-558 could hydrolyze those substrates and yielded the deacetylated products.

Cephalosporin acetylesterase เป็นเอ็นไซม์ที่ hydrolyze พันธะเอสเทอร์ที่ตำแหน่ง 3 ของโมเลกุล cephalosporin ผลผลิตจากเอนไซม์ที่ได้คือ deacetyl cephalosporin ซึ่งใช้เป็นตัวกลางในอุตสาหกรรมการผลิตยา ปฏิชีวนะกึ่งสังเคราะห์ (semisynthetic antibiotic) อย่างแพร่หลาย โดยสามารถทำการแทนที่หมู่อซิเตต (acetate group) ที่ตำแหน่ง 3 เดิม ด้วยอนุพันธุ์อื่นๆ ทำให้เกิดสาร ตัวใหม่ที่มีคุณสมบัติทางชีววิทยาแตกต่างจากเดิม เอ็นไซม์จาก Bacillus subtilis WRRL-B-558 ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธี การทำให้ร้อน (selective heat denaturation), ultrafiltration, และใช้ chromatography ชนิดคอลัมน์ คือ Q-Sepharose Fast Flow, Sephadex G-200 และ Phenyl-Sepharose CL-4B เอ็นไซม์ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ ด้วยขั้นตอนต่างๆ นี้ เมื่อนำมาศึกษาการแยกโปรตีนด้วยวิธี native-PAGE และย้อมโปรตีนด้วยวิธี silver staining รวมทั้งย้อมเอ็นไซม์ด้วย activity staining พบว่าเห็น แถบโปรตีนเพียง 1 แถบในทั้งสองวิธี นอกจากนี้ยังมี specific activity สูงกว่า 21.5 เท่าเมื่อเทียบกับ culture supernatant เมื่อศึกษาน้ำหนักโมเลกุลของ เอ็นไซม์โดยวิธี gel filtration พบว่า มีค่าประมาณ 130kDa และจากการหาขนาดหน่วยย่อย (subunit) ของ เอ็นไซม์โดยวิธี SDS-PAGE พบว่า เอ็นไซม์ประกอบด้วยหน่วย ย่อยที่เหมือนกัน 4 หน่วยย่อย ซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 32 kDa ค่าอุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำงานของเอ็นไซม์คือ 50 องศาเซลเซียส และ pH ที่เหมาะสมคือ 7.5 จากการศึกษา พบว่าเอ็นไซม์มีคุณสมบัติคงทนต่ออุณหภูมิสูง หลังจากผ่านการเก็บ ที่ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 ชั่วโมง รวมทั้งยังคงทนต่อ pH ในช่วง 5.0 ถึง 11.0 เป็นเวลาอย่างน้อย 7 วัน จากการ ศึกษา kinetic พบว่า ค่า Km และ Vmax ของเอ็นไซม์ ในการทำปฏิกิริยากับ α-naphthyl acetate เป็น 5.97 mM และ 1.47 µmol/min/ml ตามลำดับ จากการศึกษา ผลกระทบของสารต่างๆ ที่มีผลต่อการทำงานของเอ็นไซม์พบว่า Fe(3+) และ Zn(2+) สามารถยับยั้งการทำงานของเอ็นไซม์ได้ รวมทั้งการที่ phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) และ 2-mercaptoethanol มีผลต่อการทำงานของเอ็นไซม์ จึงอาจกล่าว ได้ว่าเอ็นไซม์นี้เป็น serine esterase และมี disulfide bridge เป็นองค์ประกอบสำคัญอยู่ด้วย ในขณะที่การวิเคราะห์โดยใช้ TLC และ HPLC พบว่าเอ็นไซม์จาก B. subtilis WRRL-B-558 นี้ สามารถ hydrolyze cephalosporin C และ 7-ACA ได้