Purification and characterization of enzymes involved in DNA methylation from rice
2
Issued Date
2024
Copyright Date
1995
Resource Type
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xiv, 151 leaves : ill. (some col.)
Access Rights
open access
Rights
ผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้า
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (M.Sc. (Biotechnology))--Mahidol University, 1995
Suggested Citation
Palika Kanjanavechakul Purification and characterization of enzymes involved in DNA methylation from rice. Thesis (M.Sc. (Biotechnology))--Mahidol University, 1995. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/100891
Title
Purification and characterization of enzymes involved in DNA methylation from rice
Alternative Title(s)
การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องในขบวนการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอในข้าว
Author(s)
Abstract
DNA methylation is a specific post-replicative modification of DNA involving the covalent attachment of methyl groups to certain major bases by enzymatic action in vivo. This phenomenon is catalyzed by the enzyme DNA methyltransferase (DNA MTase) which transfers methyl groups from Sadenosyl-L-methionine (methyl donor) to the specific DNA bases. DNA methylation has long been postulated as one possible mechanism of regulation of gene expression, genome imprinting and epigenetic defect in eukaryotes. Understanding the biosynthesis and functions of methylated DNA base in plant DNA requires knowledges on the structure and specificity of DNA MTase. However, these enzymes have been difficult to purify and characterize for many years, and most previous studies have dealt with rather few DNA MTase isolated from mammalian cells. On the contrary, there is a distinct lack of information about the enzymology of DNA methylation in plants. In this research, we have attempted to purify and characterize the enzyme DNA MTase from rice (0ryza sativa ssp. Indica cv. RD 23). DNA MTase activity has been observed in nuclei from hydroponically grown-rice shoot. A crude homogenate was further purified for DNA MTase by ion exchange chromatography, gel filtration chromatography and affinity cliromatography, respectively. The purification fold was 17. In parallel, nuclear DNA MTase was extracted from nuclei by salt extraction and subsequently purified by ion exchange and affinity column chromatography. The purified enzyme has specific activity increase about 41 folds as compared to those of the nuclei preparation and 706 folds when compared to the crude homogenate. The single band of DNA MTase has a molecular mass of 130 kDa using native-PAGE and that of 55 kDa by SDS-PAGE. It should be noted that the purified enzyme can be recognized by the wheat DNA MTase antibody using western blot technique. The optimum assay condition was studied using (3)H-S-adenosyl-L-methionine as a methyl donor. The optimum pH for enzyme activity is 7.6 and its optimum temperature is 25 ฐC. DNA MTase activity was found to be maximum in 10-days old rice shoots, than in mature leaves or roots, and its activity gradually decreased after 10 days germination. The purified enzyme rapidly loses activity within 24 h even if stored at 4 C in buffer containing specific protease inhibitors (pepstatin A, leupeptin and chymostatin) and several preservative agents (sucrose, PEG). The apparent Km value for salmon testis DNA substrate was 50 µg/ml. The efficient methylation of both bacterial cytosine un-methylated DNA and rice hemimethylated DNA indicated that rice DNA MTase can function in maintenance and de novo methylation. The enzyme activity was strongly inhibited by NaCl, KC1, MgCl(,2), CaCl(,2), tricationic amine (spermidine) and tetracationic arnine (spermine). Moreover, other aspects of this enzyme was to be inhibited by S-adenosylhomocysteine and DL-ethionine which are methyl donor analogs. DNA MTase is also strongly affected by DNA base analogs such as N(6)-benzyladenine and 5-azacytosine.
กลไกการทำงานของขบวนการดีเอ็นเอเมทิลเลชั่น เป็นกลไกหนึ่งซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีนในสิ่งมีชีวิต พบได้ทั้งในแบคทีเรีย สัตว์ และพืช ขบวนการเมทิลเลชั่น ของดีเอ็นเอ เกิดขึ้นโดยการทำงานของเอนไซม์ดีเอ็นเอ เมทิลทรานสเฟอเรส [DNA methyltransferase, DNA MTase] ซึ่งมีหน้าที่ในการเคลื่อนย้ายหมู่เมทิล [methyl group] จาก methyldonor [S-adenosyl- L-methionine, SAM] ไปยังตำแหน่งจำเพาะของ ดีเอ็นเอเบส ปัจจุบันขบวนการดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในพืช เริ่มมีการศึกษากันมากขึ้น แต่ก็ยังมีการศึกษาไม่กว้างนัก เมื่อเปรียบเทียบกับแบคทีเรีย และเซลล์สัตว์ ได้มีรายงาน การค้นพบบทบาทต่าง ๆ ของขบวนการนี้ในพืช แต่ในแง่ ของเอนไซม์ในขบวนการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอในพืช ยังมีการศึกษาน้อยมาก การวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาเอนไซม์ ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสโดยใช้ข้าวพันธุ์ กข 23 เป็นโมเดล ทำการแยกสกัดเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ พร้อมทั้ง ศึกษาคุณสมบัติต่าง ๆ ของเอนไซม์ เพื่อให้เข้าใจถึง บทบาทการทำงานและการควบคุมกลไกเมทิลเลชั่นของ ดีเอ็นเอในพืชได้ดียิ่งขึ้น การวิจัยนี้เริ่มจากการศึกษาวิธีสกัดเอนไซม์ ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสให้บริสุทธิ์ โดยการแยก สกัดจากส่วนต่าง ๆ ของข้าว พบว่าเอนไซม์ดีเอ็นเอ เมทิลทรานสเฟอเรสจากยอดอ่อนของข้าว [rice shoot] มี specific activity ที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบ กับส่วนรากข้าว และสูงกว่าในส่วนใบและรากข้าวจากต้น ที่เจริญเติบโตเต็มที่แล้ว ค่า enzyme activity มากที่สุด ที่อายุการงอกของข้าว 10 วัน ฉะนั้นยอดอ่อนของข้าว จึงเป็นแหล่งวัตถุดิบที่เหมาะสมในการศึกษาเอนไซม์ดีเอ็นเอ เมทิลทรานสเฟอเรส ขั้นต่อไปจึงได้ทำการแยกสกัดเอนไซม์ จาก crude homogenate และ nuclei ที่เตรียมจาก ส่วนยอดข้าวที่มีอายุการงอก 10 วัน ผ่านขบวนการทาง ชีวเคมีวิเคราะห์คือ ion exchange chromatography, gel filtration และ affinity chromatography สำหรับ crude homogenate เอนไซม์ดีเอ็นเอเมทิล ทรานสเฟอเรสที่แยกได้มีค่าความบริสุทธิ์ของเอนไซม์เพิ่ม ขึ้น [purification fold] 17 เท่า ในขณะที่เอนไซม์ ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสที่สกัดได้จากส่วน nuclei เมื่อผ่านขบวนการชีวเคมีวิเคราะห์ salt extraction, ion exchange chromatography และ affinity chromatography สามารถเพิ่มค่าความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ มากถึง 41 เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับ nuclei และ 706 เท่า เมื่อเปรียบเทียบกับ crude homogenate จากการวิเคราะห์ โดย SDS-PAGE, native-PAGE และ western blotting ด้วยแอนติบอดีของเอนไซม์นี้จากข้าวสาลี ทำให้ทราบว่า เอนไซม์ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสในข้าวประกอบด้วย subunit ขนาดน้ำหนักโมเลกุล 55 kDa มากกว่า 1 subunit และมีน้ำหนักโมเลกุลโดยรวมประมาณ 130 kDa ค่า pH ที่เหมาะสมในการทำงานของเอนไซม์ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรส คือ pH 7.6 โดยอุณหภูมิที่ให้ activity สูงสุดคือ 25 องศาเซลเซียส แต่อย่างไรก็ตาม แม้อุณหภูมิตลอดทำการ ทดลองจะถูกควบคุมที่ 4 องศาเซลเซียส เอนไซม์ดีเอ็นเอ เมทิลทรานสเฟอเรสยังคงมีการเสีย activity อย่างรวดเร็ว ภายใน 24 ชั่วโมง การเก็บรักษาเอนไซม์นี้ไว้ในที่อุณหภูมิ ต่ำถึง -80 องศาเซลเซียส ก็ยังพบการลดลงของ activity พบว่า glycerol และ dithiothreitol สามารถช่วยรักษา activity ของเอนไซม์ไว้ได้ แต่ protease inhibitor (pepstatin A, leupeptin, chymostatin) และ preservative agent (sucrose, PEG) ไม่สามารถช่วย รักษา activity ของเอนไซม์ จากการศึกษา enzyme kinetic พบว่า Km ของเอนไซม์นี้ต่อ salmon testis DNA เท่ากับ 50 µg/ml เอนไซม์นี้สามารถทำงานได้ดีเมื่อใช้ substrate เป็น cytosine un-methylated DNA ที่เตรียม จากแบคทีเรีย และ hemimethylated DNA ที่เตรียมจากข้าว แสดงว่าสามารถทำงานได้ทั้งในลักษณะ maintenance และ de novo methylation การทำงานของเอนไซม์สามารถถูก ยับยั้งได้ในสภาวะที่มีเกลือต่าง ๆ เช่น NaCl, KCl, MgCl(,2), CaCl(,2), tricationic amine และ tetracationic amine อีกด้วย ตัวยับยั้งอื่นที่มีผลกระทบ ต่อการทำงานของเอนไซม์ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรส คือ สารที่มีโครงสร้างคล้าย methyl donor [substrate analog] ซึ่งได้แก่ S-adenosylhomocysteine และ ethionine ส่วน demethylating agent (5-azacytosine) และ phytohormone (N(6,-) benzyladenine) สามารถ ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้เช่นกัน
กลไกการทำงานของขบวนการดีเอ็นเอเมทิลเลชั่น เป็นกลไกหนึ่งซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีนในสิ่งมีชีวิต พบได้ทั้งในแบคทีเรีย สัตว์ และพืช ขบวนการเมทิลเลชั่น ของดีเอ็นเอ เกิดขึ้นโดยการทำงานของเอนไซม์ดีเอ็นเอ เมทิลทรานสเฟอเรส [DNA methyltransferase, DNA MTase] ซึ่งมีหน้าที่ในการเคลื่อนย้ายหมู่เมทิล [methyl group] จาก methyldonor [S-adenosyl- L-methionine, SAM] ไปยังตำแหน่งจำเพาะของ ดีเอ็นเอเบส ปัจจุบันขบวนการดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในพืช เริ่มมีการศึกษากันมากขึ้น แต่ก็ยังมีการศึกษาไม่กว้างนัก เมื่อเปรียบเทียบกับแบคทีเรีย และเซลล์สัตว์ ได้มีรายงาน การค้นพบบทบาทต่าง ๆ ของขบวนการนี้ในพืช แต่ในแง่ ของเอนไซม์ในขบวนการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอในพืช ยังมีการศึกษาน้อยมาก การวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาเอนไซม์ ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสโดยใช้ข้าวพันธุ์ กข 23 เป็นโมเดล ทำการแยกสกัดเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ พร้อมทั้ง ศึกษาคุณสมบัติต่าง ๆ ของเอนไซม์ เพื่อให้เข้าใจถึง บทบาทการทำงานและการควบคุมกลไกเมทิลเลชั่นของ ดีเอ็นเอในพืชได้ดียิ่งขึ้น การวิจัยนี้เริ่มจากการศึกษาวิธีสกัดเอนไซม์ ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสให้บริสุทธิ์ โดยการแยก สกัดจากส่วนต่าง ๆ ของข้าว พบว่าเอนไซม์ดีเอ็นเอ เมทิลทรานสเฟอเรสจากยอดอ่อนของข้าว [rice shoot] มี specific activity ที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบ กับส่วนรากข้าว และสูงกว่าในส่วนใบและรากข้าวจากต้น ที่เจริญเติบโตเต็มที่แล้ว ค่า enzyme activity มากที่สุด ที่อายุการงอกของข้าว 10 วัน ฉะนั้นยอดอ่อนของข้าว จึงเป็นแหล่งวัตถุดิบที่เหมาะสมในการศึกษาเอนไซม์ดีเอ็นเอ เมทิลทรานสเฟอเรส ขั้นต่อไปจึงได้ทำการแยกสกัดเอนไซม์ จาก crude homogenate และ nuclei ที่เตรียมจาก ส่วนยอดข้าวที่มีอายุการงอก 10 วัน ผ่านขบวนการทาง ชีวเคมีวิเคราะห์คือ ion exchange chromatography, gel filtration และ affinity chromatography สำหรับ crude homogenate เอนไซม์ดีเอ็นเอเมทิล ทรานสเฟอเรสที่แยกได้มีค่าความบริสุทธิ์ของเอนไซม์เพิ่ม ขึ้น [purification fold] 17 เท่า ในขณะที่เอนไซม์ ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสที่สกัดได้จากส่วน nuclei เมื่อผ่านขบวนการชีวเคมีวิเคราะห์ salt extraction, ion exchange chromatography และ affinity chromatography สามารถเพิ่มค่าความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ มากถึง 41 เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับ nuclei และ 706 เท่า เมื่อเปรียบเทียบกับ crude homogenate จากการวิเคราะห์ โดย SDS-PAGE, native-PAGE และ western blotting ด้วยแอนติบอดีของเอนไซม์นี้จากข้าวสาลี ทำให้ทราบว่า เอนไซม์ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสในข้าวประกอบด้วย subunit ขนาดน้ำหนักโมเลกุล 55 kDa มากกว่า 1 subunit และมีน้ำหนักโมเลกุลโดยรวมประมาณ 130 kDa ค่า pH ที่เหมาะสมในการทำงานของเอนไซม์ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรส คือ pH 7.6 โดยอุณหภูมิที่ให้ activity สูงสุดคือ 25 องศาเซลเซียส แต่อย่างไรก็ตาม แม้อุณหภูมิตลอดทำการ ทดลองจะถูกควบคุมที่ 4 องศาเซลเซียส เอนไซม์ดีเอ็นเอ เมทิลทรานสเฟอเรสยังคงมีการเสีย activity อย่างรวดเร็ว ภายใน 24 ชั่วโมง การเก็บรักษาเอนไซม์นี้ไว้ในที่อุณหภูมิ ต่ำถึง -80 องศาเซลเซียส ก็ยังพบการลดลงของ activity พบว่า glycerol และ dithiothreitol สามารถช่วยรักษา activity ของเอนไซม์ไว้ได้ แต่ protease inhibitor (pepstatin A, leupeptin, chymostatin) และ preservative agent (sucrose, PEG) ไม่สามารถช่วย รักษา activity ของเอนไซม์ จากการศึกษา enzyme kinetic พบว่า Km ของเอนไซม์นี้ต่อ salmon testis DNA เท่ากับ 50 µg/ml เอนไซม์นี้สามารถทำงานได้ดีเมื่อใช้ substrate เป็น cytosine un-methylated DNA ที่เตรียม จากแบคทีเรีย และ hemimethylated DNA ที่เตรียมจากข้าว แสดงว่าสามารถทำงานได้ทั้งในลักษณะ maintenance และ de novo methylation การทำงานของเอนไซม์สามารถถูก ยับยั้งได้ในสภาวะที่มีเกลือต่าง ๆ เช่น NaCl, KCl, MgCl(,2), CaCl(,2), tricationic amine และ tetracationic amine อีกด้วย ตัวยับยั้งอื่นที่มีผลกระทบ ต่อการทำงานของเอนไซม์ดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรส คือ สารที่มีโครงสร้างคล้าย methyl donor [substrate analog] ซึ่งได้แก่ S-adenosylhomocysteine และ ethionine ส่วน demethylating agent (5-azacytosine) และ phytohormone (N(6,-) benzyladenine) สามารถ ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้เช่นกัน
Description
Biotechnology (Mahidol University 1995)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Biotechnology
Degree Grantor(s)
Mahidol University