Transcription of the larvicidal cry4Ba gene from Bacillus thuringinesis in the green algal Chlamydomonas reinhardtii chloroplast

Abstract

The well-known single cell green alga Chlamydomonas reinhardtii has been recognized as a potential platform for expression of recombinant proteins due to its potential for large scale production as well as low maintenance costs. In this study, transcription of the 3.4-kb mosquito-larvicidal cry4Ba gene from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) in transgenic chloroplasts of C. reinhardtii under control of the promoter and 5'-UTR of photosynthetic psbA gene was achieved. Inverted repeats in a chloroplast genome of the host strain with deleted photosynthetic psbA genes were selected as recombination targets. Three transformant lines showing stable and site-specific integration of intact cry4Ba and psbA genes into C. reinhardtii chloroplast genomes were obtained by means of dual-phenotypic screening via exhibition of resistance to spectinomycin and restoration of the photosynthetic activity. Achievement in co-transcription of recombinant cry4Ba and psbA transgenes in all stable lines revealed by RT-PCR and Northern blot analyses demonstrates the sufficiency of this system's transcription machinery, offering further innovation for Bt-insecticidal protein production.

Chlamydomonas reinhardtii เป็นสาหร่ายสีเขียวเซลล์เดียว ที่ได้รับการยอมรับว่าเป็นต้นแบบที่มีศักยภาพสำหรับการแสดงออกของโปรตีนลูกผสม (recombinant proteins) เนื่องด้วยเป็นเซลล์ที่มีประสิทธิภาพในการผลิตโปรตีนได้ปริมาณสูงและมีค่าใช้จ่ายในการบำรุงรักษาต่ำ ในการศึกษานี้ได้ประสบความสำเร็จในการถอดรหัสหรือการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอของยีนที่สร้างโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุง cry4Ba ที่มีขนาด 3.4 กิโลเบส จากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis สายพันธุ์ israelensis ในคลอโรพลาสต์ของสาหร่าย C. reinhardtii ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์และ 5'UTR (บริเวณที่ไม่มีการสร้างโปรตีน) ที่ได้จากยีนสังเคราะห์แสง psbA ในการนี้ตำแหน่งที่บรรจุยีน (recombinant proteins) ได้ถูกเลือกให้อยู่บริเวณที่เป็น inverted repeats ภายในคลอโรพลาสต์ของสาหร่ายสายพันธุ์ซึ่งไม่มียีน psbA จากการศึกษาพบว่าได้สาหร่ายลูกผสม 3 ตัวอย่างซึ่งสามารถแสดงการมีอยู่อย่างจำเพาะและถาวรของยีน cry4Ba และ psbA ภายในจีโนมคลอโรพลาสต์ของ C. reinhardtii โดยได้มาจากการคัดเลือกแบบลักษณะของการแสดงออกทั้ง 2 วิธี อันได้แก่การแสดงออกของความต้านทานยาปฏิชีวนะ spectinomycin และการคืนความสามารถของกระบวนการสังเคราะห์แสง โดยที่ความสำเร็จในการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอของยีนลูกผสม cry4Ba และ psbA ในทุกตัวอย่างของสาหร่ายลูกผสมนั้นได้ผลมาจากการวิเคราะห์ด้วย RT-PCR และ Northern blot ซึ่งได้แสดงถึงความเพียงพอของทรัพยากรที่ใช้ในการถอดรหัสดีเอ็นเอของระบบนี้นำพาไปสู่นวัตกรรมก้าวหน้าสำหรับการผลิตโปรตีนสารพิษจากแบคทีเรีย Bt ในอนาคตต่อไป