Immunoassays of amphetamines : structure of immunogen versus antibody specificity

Abstract

The present study was carried out with 2 objectives. The first objective was to develop an immunoassay based on a reverse latex agglutination inhibition (RLI) test using antibody raised against methamphetamine. The characteristics of the test with respect to sensitivity and specificity were recorded. The second objective was to formulate a "structure-specificity" relationship using the specificity data gathered above on specificity, together with all available information on immunoassays of amphetamines, especially with regard to the structure of immunogen used and the specificity. methamphetamne but contained an extra 4 atom extension from the amino groups. This derivative was then conjugated with purified tetanus toxoid (PTT) by using a carbodiimide coupling reagent. The conjugate was used to raise antibody in rabbits. The antibody, purified by ammonium sulfate precipitation followed by ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex, was used to coat latex particles. These antibody sensitized latex particles agglutinated in the presence of an antigen prepared by conjugating APMA to bovine serum albumin. Various drugs and chemicals were tested for their ability to inhibit this agglutination reaction. The optimal conditions for the reverse latex agglutination inhibition (RLI) test were established. Specifically, the latex particles were coated with 150 µg/ml of IgG at 37 degree C for 30 mins in 0.1 M glycine buffered saline, pH 8.2. In the inhibition reaction, drugs and chemicals were preincubated with IgG-sensitized latex particles at 37 degree C for 30 mins. It was found that the sensitivities of the RLI for methamphetamine and amphetamine were 0.25 µg/ml and 14.6 µg/ml respectively. I-Ephedrine and p-hydroxymethamphetamine respectively, were 512 and 1,250 times, respectively less reactive than methamphetamine in this RLI test. Various commonly used drugs and chemicals including urine failed to inhibit the RLI reaction. This RLI test, when used in combination of the RLI test for amphetamine reported earlier (J. Immunol. Methods 157, (1993) 189-195) would distinguish which of the amphetamines (methamphetamine or amphetamine) was present in a urine sample. Information on the structure of the immunogen used in this study and the specificity of the antibody obtained, together with corresponding data present in the literature have allowed the formulation of a "structure-specificity" pattern, delineated on the basis of immunochemistry and stereochemistry. The "structure-specificity" relationship should be useful for future developments of these immunoassays. Specifically, immunoassays intended to detect either amphetamine or methamphetamine with minimal cross-reaction, should employ immunogen with amphetamine (or methamphetamine) derivatized via the para position of the phenyl ring. Such assays should show minimal cross-reaction with other secondary (or tertiary) amines but should strongly cross-react with phenyl ring substituted analogs. On the other hand, assays intended for detection of both amphetamine and methamphetamine should employ amphetamine (rather than methamphetamine) derivatized via its amino group as an immunogen. Such assays should show minimal cross-reaction with other tertiary amines and phenyl-substituted amphetamine/methamphetamine.

การศึกษาวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์หลัก 2 ประการคือ หนึ่ง เพื่อพัฒนาวิธีวิเคราะห์สารประเภทแอมเฟตามีน โดย อาศัยหลัก reverse latex agglutination inhibition (RLI) ด้วยแอนติบอดี้ที่ผลิตต่อสารเมทแอมเฟตามีน และศึกษา คุณสมบัติของวิธีวิเคราะห์นี้ในด้านความไว และความจำเพาะ ต่อยา และสารเคมีต่าง ๆ วัตถุประสงค์ที่สองคือ จากความรู้ ที่ได้ในการศึกษาดังกล่าวข้างต้นประกอบกับข้อมูลต่าง ๆ ที่มีในวารสารในเรื่องการวิเคราะห์สารแอมเฟตามีนโดยวิธี ทางอิมมูโน โดยเฉพาะอย่างยิ่งคุณสมบัติของวิธีวิเคราะห์ ในด้านความไว และความจำเพาะ เพื่อนำมาวิเคราะห์หาความ สัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างของอิมมูโนเจนที่ใช้ และความ จำเพาะของแอนติบอดี้ที่ผลิตขึ้น ในการพัฒนาวิธี RLI ดังกล่าว ได้ทำการสังเคราะห์ อนุพันธ์ของเมทแอมเฟตามีนคือ N-(3-aminopropyl) methamphetamine (APMA) ซึ่งยังคงสภาพของ amino group อยู่ และมีแขนยาวออกไปอีก 4 อณู ได้นำอนุพันธ์ APMA มา เชื่อมกับ purified tetanus toxoid (PTT) โดยใช้ carbodiimide เป็นตัวเชื่อม และนำไปฉีดกระต่ายเพื่อกระตุ้น การสร้างภูมิคุ้มกัน ได้นำเซรุ่มจากกระต่ายมาทำ IgG ให้บริสุทธิ์โดยวิธีตกตะกอนในแอมโมเนียมซัลเฟต และตามด้วย โครมาโตกราฟี่บน DEAE Sephadex IgG ที่ได้ถูกนำมาเคลือบ บนเม็ดลาเท็กส์ และทำ latex agglutination โดยเติม สารแอนติเจนที่เป็น bovine serum albumin เชื่อมติดกับ APMA ได้นำตัวยาและสารเคมีต่าง ๆ มาทดสอบความสามารถ ในการยับยั้งปฏิกิริยา latex agglutination นี้ และได้หา สภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยาต่าง ๆ ดังกล่าว โดยพบ ว่าการเคลือบเม็ดลาเท็กส์ควรใช้ IgG ที่ความเข้มข้น 150 ไมโครกรัม/มล. ที่ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที ใน 0.1M glycine buffered saline, pH 8.2 ส่วนการทำ reverse latex agglutination inhibition (RLI) นั้น ควรอบสารที่ต้องการทดสอบกับเม็ดลาเท็กส์ที่เคลือบ แล้วด้วย IgG เป็นเวลาอย่างน้อย 30 นาที ที่ 37 องศาเซลเซียส จากการทดลองพบว่าวิธี RLI ดังกล่าวสามารถวิเคราะห์สาร เมทแอมเฟนามีนและสารแอมเฟตามีนได้ที่ความเข้มข้น 0.25 และ 14.6 ไมโครกรัม/มล. ตามลำดับ ส่วนสาร 1-ephedrine และ p-hydroxymethampheta- mine นั้น สามารถวิเคราะห์ ได้ที่ความเข้มข้น 512 และ 1,250 เท่าของความเข้มข้นของ เมทแอมเฟตามีนตามลำดับ และยังพบว่ายาและสารเคมีต่าง ๆ รวมทั้งปัสสาวะจากคนปกติไม่มีผลต่อปฏิกิริยา RLI นี้ ดังนั้นวิธี RLI ที่พัฒนาขึ้นนี้จึงมีประโยชน์เมื่อใช้ร่วมกับวิธี RLI ที่ถูกพัฒนาเพื่อการวิเคราะห์แอมเฟตามีน (J. Immunol. Methods, 157 (1993) 189-195) ในการแยกแยะว่าใน ปัสสาวะของผู้เสพนั้นมีสารแอมเฟตามีนหรือสารเมทแอมเฟตามีน จากข้อมูลที่ได้เกี่ยวกับความไวและความจำเพาะของ วิธี RLI ที่กล่าวข้างต้น ประกอบกับข้อมูลที่มีอยู่ในวารสาร ต่าง ๆ เกี่ยวกับความไว และความจำเพาะของวิธีวิเคราะห์ สารประเภทแอมเฟตามีนที่เคยถูกพัฒนามาก่อนทำให้สามารถ สังเคราะห์แนวความสัมพันธ์ของโครงสร้างทางเคมีของ อิมมูโนเจนที่ใช้กระตุ้น กับความจำเพาะของแอนติบอดี้ที่ สัตว์ผลิตขึ้นตอบสนองความสัมพันธ์ในด้านโครงสร้างและความ จำเพาะ (immunogen structure and antibody specificity relationship) นี้ เป็นประโยชน์อย่างยิ่งต่อความเข้าใจ ความจำเพาะของแอนติบอดี้ และต่อการวางแผนการพัฒนาวิธี วิเคราะห์ประเภทแอมเฟตามีนโดยทางอิมมูโนในอนาคต โดย สามารถกล่าวโดยสรุปดังนี้คือ ก) วิธีวิเคราะห์ที่ใช้ตรวจ เฉพาะสารแอมเฟตามีน หรือเมทแอมเฟตามีน อย่างใดอย่างหนึ่ง เพียงอย่างเดียว ควรพัฒนาโดยเริ่มต้นจากการใช้อิมมูโนเจน ที่สังเคราะห์จากสารแอมเฟตามีน (หรือเมทแอมเฟตามีน) ที่เชื่อมจาก paraposition ของ phenyl ring วิธีการ วิเคราะห์นี้จะแสดงปฏิกิริยาข้ามกลุ่ม (cross reaction) น้อยมากต่อสาร secondary (หรือ tertiary amines) แต่จะแสดงปฏิกิริยาข้ามกลุ่มอย่างรุนแรงต่ออนุพันธ์ประเภท ring substituted (เมท) แอมเฟตามีน ข) วิธีวิเคราะห์ ที่สามารถใช้ตรวจพบได้ทั้งสารแอมเฟตามีน และเมทแอมเฟตามีน ควรพัฒนาโดยเริ่มต้นจากการใช้แอมเฟตามีน (ไม่ใช้ เมทแอมเฟตามีน) ที่เชื่อมต่อที่ amino group เป็นสาร อิมมูโนเจน วิธีการวิเคราะห์ที่ได้จะแสดงปฏิกิริยาข้ามกลุ่ม น้อยมากกับสารประเภท tertiary amines อื่น ๆ และ phenyl-substituted แอมเฟตามีน หรือเมทแอมเฟตามีน