Development of peptide inhibitors against dengue virus infection by in silico desigh and in vitro studies
4
Issued Date
2023
Copyright Date
2014
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xiv,158 leaves : ill.
Access Rights
restricted access
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (Ph.D. (Biochemistry))--Mahidol University, 2014
Suggested Citation
Aussara Panya Development of peptide inhibitors against dengue virus infection by in silico desigh and in vitro studies. Thesis (Ph.D. (Biochemistry))--Mahidol University, 2014. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/89738
Title
Development of peptide inhibitors against dengue virus infection by in silico desigh and in vitro studies
Alternative Title(s)
การพัฒนาเปปไทด์เพื่อยับยั้งการติดเชื้อไวรัสเดงกีโดยการออกแบบด้วยคอมพิวเตอร์และการศึกษาทางห้องปฏิบัติการ
Author(s)
Abstract
Dengue virus (DENV) infection is a global major concern with over 50 million reported cases a year. Presently, there are neither any approved vaccines nor effective drugs that are available; therefore, the development of anti-DENV drug is urgently needed. Several clinical reports revealed a positive association between the viremia and disease severity suggesting that the anti-DENV drug therapy can possibly ameliorates the disease severity as well as ending the transmission circuit to control the current outbreak situation. The surface envelope (E) protein of DENV is critical for the viral entry step which includes attachment and membrane fusion; thus, the blocking of envelope protein is an attractive strategy for anti-DENV drug development. This study aimed to search for novel peptide inhibitors to counter DENV infection through the targeting of E protein using a structure-based in silico design. Two selected strategies of inhibition included interference of membrane fusion process whereby the hydrophobic pocket on the E protein was the target, and the destabilization of virion structure organization through the disruption of the interaction between the envelope and membrane proteins, respectively. Following the first strategy, molecular docking technique was used to identify small peptides targeting the hydrophobic pocket. In the second strategy, the design of peptide inhibitor mimicking the ectodomain portion of membrane protein was performed to interfere with the protein-protein interaction. The designed peptides were tested for cytotoxicity to host cell, and its inhibitory effect on DENV foci formation in Vero cells. The peptide effects were further charaterized on the reduction of DENV genome, protein, and infectivity levels by using real-time PCR, cell-based flavivirus immunodetection and immunofluorence assay. Finally, the peptide inhibitory effect was tested with all four DENV serotypes (DENV1, DENV2, DENV3, and DENV4) in an effort to study the cross-serotype antiviral activity. Using a computer-aided design, peptide inhibitors targeting hydrophobic pocket revealed di-peptide inhibitor, Glu-Phe (EF), effectively inhibited DENV infection in cell culture system. Its most potential effect was observed for DENV2 with a half maximal inhibition concentration (IC50) of 96 ?gM, but it partially inhibited other serotypes. Treatment of EF at 200 ??M on infected cells also significantly reduced the viral genome and protein to 83.47% and 84.15%, respectively, corresponding to the reduction of infected cell numbers. An additional approach was carried out by using peptide mimicking membrane (M) protein, namely MLH40. Treatment of MLH40 caused the reduction of foci formation in four individual DENV serotype (DENV1-4) with IC50 of 24-31 ugM. Further charaterization suggested that the MLH40 specifically blocked viral attachment to host membrane, and treatment with 100 ?gM could diminish 80% of viral attachment. The inhibitory effect of MLH40 was observed in various target cell types including Vero, A549, and Huh7 cells at low-micromolar level. The molecular docking technique suggested that MLH40 interacting with envelope proteins can disrupt their regular dimer conformation. The binding of peptide to the target site was a key underlining the inhibitory effect. In summary, the designed peptide inhibitors targeting DENV E protein on hydrophobic pocket and M-binding site could inhibit the virus infection in a cell culture system. The results provide proofof- concept for the development of antiviral therapeutic peptide inhibitors to counter DENV infection through the use of a structure-based design targeting conserved viral protein.
โรคไข้เลือดออกจากการติดเชื้อไวรัสเดงกีเป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญระดับโลก ซึ่งในแต่ละปี มีแนวโน้ม ผู้ป่วยติดเชื้อไวรัสเดงกีเพิ่มมากขึ้น ปัจจุบันยังไม่มีวัคซีนป้ องกันและยารักษาโรคไข้เลือดออกที่มีความจำเพาะ การรักษาหลัก เป็นเพียงแบบประคับคองอาการเท่านั้น ที่ผ่านมาได้มีการรายงานว่ากลุ่มผู้ป่วยไข้เลือดออกที่มีความรุนแรงมากมีระดับไวรัสใน กระแสเลือดมากกว่ากลุ่มผู้ป่วยที่มีความรุนแรงของโรคน้อย สะท้อนให้เห็นว่ายาต้านไวรัสมีความเป็นได้สูงที่จะนำมาใช้เพื่อลด ระดับความรุนแรงของโรคไข้เลือดออกได้ เพราะฉะนั้นการค้นหาและพัฒนายาต้านไวรัสจึงมีความสำคัญและจำเป็นเป็นอย่างยิ่ง การยับยั้งกระบวนการเข้าเซลล์เจ้าบ้านของไวรัส โดยยับยั้งการทำงานของโปรตีนผิว (envelope) เป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพ ในการยับยั้งการเพิ่มจำนวนไวรัสที่จำเป็นต้องอาศัยเซลล์เจ้าบ้าน การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อค้นหาและพัฒนายาต้านไวรัส ชนิดเปปไทด์ เพื่อยับยั้งการเพิ่มจำนวนของไวรัสเดงกี โดยมีโปรตีนผิว (envelope) เป็นเป้ าหมาย ซึ่งแบ่งตามกระบวนการวิจัย เป็นสองส่วน ได้แก่ การค้นหาเปปไทด์โดยเทคนิคทางคอมพิวเตอร์และการจำลองเปปไทด์จากโปรตีนของไวรัสเอง จากนั้น เปปไทด์ที่ถูกออกแบบได้รับการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์และทดสอบการยับยั้งการติดเชื้อไวรัสเดงกีในเซลล์เพาะเลี้ยง การ ใช้เทคนิคทางคอมพิวเตอร์ซึ่งเป็นกระบวนการวิจัยแรกมีวัตถุประสงค์เพื่อค้นหาเปปไทด์สายสั้น ที่มีความจำเพาะต่อบริเวณ Hydrophobic pocket บนโปรตีนผิวซึ่งมีการรายงานว่าเป็นบริเวณที่มีความสำคัญต่อการทำงานของโปรตีน จากผลการทดลอง พบว่า ไดเปปไทด์ที่ประกอบด้วยอะมิโนเอซิด กลูตาเมทและฟีนิวอาลานิน (EF) มีความสามารถสูงสุดในการยับยั้งเชื้อไวรัส เดงกีในเซลล์เพาะเลี้ยง โดยมีค่าความเข้มข้นที่สามารถลดการติดเชื้อครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 96 M ไดเปปไทด์มีประสิทธิภาพ ดีที่สุดในการยับยั้ง ไวรัสเดงกีซีโรไทป์ 2 แต่ยับยั้งซีโรไทป์ อื่นได้ในระดับที่ต่ำกว่า กระบวนการวิจัยที่สองคือการจำลองเปป ไทด์จากโปรตีนของไวรัส คือ โปรตีน membrane เพื่อรบกวนการจับกันระหว่างโปรตีน envelope และ membrane ที่มีส่วน สำคัญในการรักษาเสถียรภาพทาง โครงสร้างของไวรัส พบว่าเปปไทด์จำลอง ตั้งชื่อว่า MLH40 มีคุณสมบัติในการยับยั้งการติด เชื้อของไวรัสเดงกีได้ทุกซีโรไทป์ ในระดับที่ใกล้เคียงกัน (IC50 ระหว่าง 24-31 μM) จากการทดสอบกลไกการทำงานพบว่า MLH40 สามารถลดความสามารถของไวรัสในการจับกับผิวเซลล์อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ นอกจากนี้เปปไทด์ในระดับความ เข้มข้นต่ำยังสามารถยับยั้งการเพิ่มจำนวนของไวรัสเซลล์เพาะเลี้ยงหลายชนิดได้แก่ Vero, A549, Huh7 จากการใช้โปรแกรม คอมพิวเตอร์ในการจำลองการจับกันระหว่าง MLH40 และโปรตีนผิว พบว่า MLH40 จับโปรตีนผิวโดยอาศัยบริเวณปลายทาง ด้าน N-terminus โดยการจับกันนี้เชื่อว่าจะรบกวนโครงสร้าง dimer ของโปรตีนผิวและส่งผลต่อความสามารถในการจับกับผิว เซลล์ของไวรัส การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงกระบวนค้นหายาต้านไวรัสชนิดเปปไทด์ที่มีประสิทธิภาพและเปปไทด์ที่ได้จากการ ทดลองนี้อาจจะสามารถนำไปพัฒนาต่อยอดเพื่อการรักษาโรคไข้เลือดออกได้ในอนาคต
โรคไข้เลือดออกจากการติดเชื้อไวรัสเดงกีเป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญระดับโลก ซึ่งในแต่ละปี มีแนวโน้ม ผู้ป่วยติดเชื้อไวรัสเดงกีเพิ่มมากขึ้น ปัจจุบันยังไม่มีวัคซีนป้ องกันและยารักษาโรคไข้เลือดออกที่มีความจำเพาะ การรักษาหลัก เป็นเพียงแบบประคับคองอาการเท่านั้น ที่ผ่านมาได้มีการรายงานว่ากลุ่มผู้ป่วยไข้เลือดออกที่มีความรุนแรงมากมีระดับไวรัสใน กระแสเลือดมากกว่ากลุ่มผู้ป่วยที่มีความรุนแรงของโรคน้อย สะท้อนให้เห็นว่ายาต้านไวรัสมีความเป็นได้สูงที่จะนำมาใช้เพื่อลด ระดับความรุนแรงของโรคไข้เลือดออกได้ เพราะฉะนั้นการค้นหาและพัฒนายาต้านไวรัสจึงมีความสำคัญและจำเป็นเป็นอย่างยิ่ง การยับยั้งกระบวนการเข้าเซลล์เจ้าบ้านของไวรัส โดยยับยั้งการทำงานของโปรตีนผิว (envelope) เป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพ ในการยับยั้งการเพิ่มจำนวนไวรัสที่จำเป็นต้องอาศัยเซลล์เจ้าบ้าน การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อค้นหาและพัฒนายาต้านไวรัส ชนิดเปปไทด์ เพื่อยับยั้งการเพิ่มจำนวนของไวรัสเดงกี โดยมีโปรตีนผิว (envelope) เป็นเป้ าหมาย ซึ่งแบ่งตามกระบวนการวิจัย เป็นสองส่วน ได้แก่ การค้นหาเปปไทด์โดยเทคนิคทางคอมพิวเตอร์และการจำลองเปปไทด์จากโปรตีนของไวรัสเอง จากนั้น เปปไทด์ที่ถูกออกแบบได้รับการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์และทดสอบการยับยั้งการติดเชื้อไวรัสเดงกีในเซลล์เพาะเลี้ยง การ ใช้เทคนิคทางคอมพิวเตอร์ซึ่งเป็นกระบวนการวิจัยแรกมีวัตถุประสงค์เพื่อค้นหาเปปไทด์สายสั้น ที่มีความจำเพาะต่อบริเวณ Hydrophobic pocket บนโปรตีนผิวซึ่งมีการรายงานว่าเป็นบริเวณที่มีความสำคัญต่อการทำงานของโปรตีน จากผลการทดลอง พบว่า ไดเปปไทด์ที่ประกอบด้วยอะมิโนเอซิด กลูตาเมทและฟีนิวอาลานิน (EF) มีความสามารถสูงสุดในการยับยั้งเชื้อไวรัส เดงกีในเซลล์เพาะเลี้ยง โดยมีค่าความเข้มข้นที่สามารถลดการติดเชื้อครึ่งหนึ่ง (IC50) เท่ากับ 96 M ไดเปปไทด์มีประสิทธิภาพ ดีที่สุดในการยับยั้ง ไวรัสเดงกีซีโรไทป์ 2 แต่ยับยั้งซีโรไทป์ อื่นได้ในระดับที่ต่ำกว่า กระบวนการวิจัยที่สองคือการจำลองเปป ไทด์จากโปรตีนของไวรัส คือ โปรตีน membrane เพื่อรบกวนการจับกันระหว่างโปรตีน envelope และ membrane ที่มีส่วน สำคัญในการรักษาเสถียรภาพทาง โครงสร้างของไวรัส พบว่าเปปไทด์จำลอง ตั้งชื่อว่า MLH40 มีคุณสมบัติในการยับยั้งการติด เชื้อของไวรัสเดงกีได้ทุกซีโรไทป์ ในระดับที่ใกล้เคียงกัน (IC50 ระหว่าง 24-31 μM) จากการทดสอบกลไกการทำงานพบว่า MLH40 สามารถลดความสามารถของไวรัสในการจับกับผิวเซลล์อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ นอกจากนี้เปปไทด์ในระดับความ เข้มข้นต่ำยังสามารถยับยั้งการเพิ่มจำนวนของไวรัสเซลล์เพาะเลี้ยงหลายชนิดได้แก่ Vero, A549, Huh7 จากการใช้โปรแกรม คอมพิวเตอร์ในการจำลองการจับกันระหว่าง MLH40 และโปรตีนผิว พบว่า MLH40 จับโปรตีนผิวโดยอาศัยบริเวณปลายทาง ด้าน N-terminus โดยการจับกันนี้เชื่อว่าจะรบกวนโครงสร้าง dimer ของโปรตีนผิวและส่งผลต่อความสามารถในการจับกับผิว เซลล์ของไวรัส การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงกระบวนค้นหายาต้านไวรัสชนิดเปปไทด์ที่มีประสิทธิภาพและเปปไทด์ที่ได้จากการ ทดลองนี้อาจจะสามารถนำไปพัฒนาต่อยอดเพื่อการรักษาโรคไข้เลือดออกได้ในอนาคต
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Department
Faculty of Medicine Siriraj Hospital
Degree Discipline
Biochemistry
Degree Grantor(s)
Mahidol University