Regulation of neural differentiation in human pluripotent embryonal carcinoma stem cells by RNA signaling

Abstract

Pluripotent stem cells are important sources for cell-based therapy, including treatment for neurological deficits. Understanding the process of neural differentiation is important for the development of methods needed to differentiate specific neural cells for treatment. It can also be a platform for studying pathogenesis of neurodevelopmental disorder. In the present study, human pluripotent embryonal carcinoma stem cells, NTERA2, were used as a model to study the neural differentiation process via induction by retinoic acid. The regulation by Paired-box 6 (PAX6), a transcription factor which has been shown as a neural fate determinant of human embryonic stem cells, was tested. An RNA-protein complex comprised of RNA signaling molecules; including CTCF, DDX5 and PUS1, with a long noncoding RNA, namely steroid receptor RNA co-activator (SRA), has been shown to regulate transcriptional activity at different targets. However, CTCF is the only component in the complex shown to regulate PAX6, the information of other components is still missing. Chromatin immunoprecipitation experiment was employed to identify the association of those proteins to the regulatory elements of PAX6 gene. Furthermore, the involvement of the RNAprotein complex in differentiation of NTERA2 was evaluated by loss of function and gain of function experiments, coupled with differentiation induced with retinoic acid treatment. The results revealed that both PAX6A and PAX6B isoforms are able to specify neural differentiation in NTERA2 cells. The association of PUS1 to P1 promoter provides an indication of the role of PUS1 on initiation of PAX6 transcription, while CTCF and DDX5 associations suggest a stabilizing mechanism for the transcription. Loss of SRA induced neural differentiation, while loss of DDX5 and PUS1 favored differentiation into other lineages and suppressed PAX6 expression. Over-expression of DDX5 and DDX17 in NTERA2 cells increased neural differentiation for which DDX17 was important for maturation of neuronal cells. Over-expression of PUS1 resulted in faster advancing the process of neural differentiation and expression of PAX6, whereas results from over-expression of catalytic inactive mutant form of PUS1 were not different compared to that of control. These results suggest a relationship between RNA pseudo-uridylation and transcription of PAX6 gene, which further suggests an engagement of RNA structure to the transcriptional machinery. In conclusion, this study demonstrates the collaboration between RNA and protein structure on regulation of gene expression as well as the process of neural differentiation from pluripotent stem cells.

เซลล์ต้นกำเนิดแบบ pluripotent เป็นแหล่งสำคัญสำหรับการทำเซลล์บำบัด ซึ่งสามารถใช้ในการ รักษาโรคทางระบบประสาทได้ การทำความเข้าใจกระบวนการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ในระบบประสาทจากเซลล์ ต้นกำเนิดจึงมีความสำคัญต่อการผลิตเซลล์เพื่อนำไปใช้ในการรักษา และความเข้าใจดังกล่าวยังสามารถต่อยอด การศึกษากระบวนการก่อโรคของโรคพัฒนาการทางระบบประสาทได้อีกด้วย ในงานวิจัยนี้ผู้วิจัยได้ทำการศึกษา กระบวนการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ในระบบประสาทโดยใช้เซลล์มะเร็งต้นกำเนิด NTERA2 ผ่านการเหนี่ยวนำ ด้วยสาร retinoic acid โดยศึกษาผลของ Paired-box 6 (PAX6) ซึ่งมีบทบาทสำคัญต่อการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ต้น กำเนิดตัวอ่อนของมนุษย์ให้เป็นเซลล์ในระบบประสาท และศึกษาการควบคุมการแสดงออกของยีน PAX6 ภายใต้ การควบคุมของ RNA-protein complex จากการรวมตัวกันของ CTCF, DDX5 และ PUS1 ที่สร้างพันธะร่วมกับ RNA ชื่อ steroid receptor RNA co-activator (SRA) ซึ่งมีเพียง CTCF ที่มีการยืนยันความสัมพันธ์กับการควบคุม การแสดงออกของยีน PAX6 ผู้วิจัยยังได้ศึกษาความเชื่อมโยงระหว่าง RNA-protein complex ดังกล่าวกับการ เปลี่ยนแปลงสภาพของเซลล์ NTERA2 ผลการศึกษาแสดงว่า ทั้งไอโซฟอร์มPAX6A และ PAX6B สามารถ กำหนดให้เซลล์ NTERA2 เปลี่ยนสภาพเป็นเซลล์ในระบบประสาท PUS1 มีความเกี่ยวข้องกับการเริ่มต้นถอดรหัส ยีน PAX6 ผ่าน P1 promoter ในขณะที่บทบาทของ CTCF และ DDX5 คือการควบคุมความเสถียร เมื่อลดปริมาณ SRA พบว่าเซลล์ NTERA2 เปลี่ยนสภาพเป็นเซลล์ของระบบประสาท ในขณะที่เมื่อลด DDX5 และ PUS1 ให้ผล ตรงกันข้าม เมื่อเพิ่มปริมาณ DDX5 และ DDX17 สามารถเหนี่ยวนำการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ระบบประสาท เพิ่มขึ้น โดย DDX17 สำคัญต่อการเปลี่ยนแปลงให้เป็นเซลล์ประสาทที่สมบูรณ์ เมื่อเพิ่มปริมาณของ PUS1 ส่งผล ให้กระบวนการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ในระบบประสาท และการแสดงออกของ PAX6 เกิดเร็วขึ้น ในขณะที่ผล ดังกล่าวไม่เกิดกับการเพิ่มปริมาณของ PUS1 ในรูปแบบที่ทำปฏิกิริยากับ RNA ไม่ได้ ผลการวิจัยนี้สรุปได้ว่า ใน กระบวนการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ในระบบประสาทจากเซลล์มะเร็งต้นกำเนิดนั้น การทำงานร่วมกันระหว่าง โครงสร้างอาร์เอ็นเอและโปรตีนมีบทบาทในการควบคุมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับระบบประสาท และมีความสำคัญในกระบวนการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ในระบบประสาทอีกด้วย