Purification and characterization of DNA replicating enzymes from human malaria parasite, plasmodium falciparum

Abstract

Plasmodium falciparum, the most virulent of the four human malaria parasites, has now developed resistance to nearly all of the widely available antimalarial drugs. Thus development of new antimalarial drugs and identification of potential target enzymes are urgently needed. Two enzymes involved in DNA replication of P. falciparum, DNA topoisomerase II and DNA polymerase ỵ, were chosen as possible target enzymes in this study. DNA topoisomerase II was partially purified by FPLC using three columns: Econo Pac Q, heparin-agarose, Mono Q. The fold purification was 3 with 25 % yield. Silver staining of SDS-polyacrylamide gel showed that the size of P. falciparum DNA topoisomerase II was 160 kDa which was similar to that observed in other eukaryotes. Reaction with a commercial polyclonal anti-human topoisomerase II antibody showed that P. falciparum topoisomerase II did not share a common C-terminal epitope. Purification of DNA polymerase ỵ was conducted using two columns of FPLC: Econo Pac Q and Mono S. Although activity of P. falciparum DNA polymerase ỵ (aphidicolin-resistant) could not be separated from aphidicolin-sensitive DNA polymerase, a band of 150 kDa become prominent during the purification steps. N-terminal sequencing of this putative DNA polymerase ỵ by Edman degradation showed an assignment of Met Glu Asn Lys Glu Lys Val Leu Asp (MENKEKVLD).

โรคมาลาเรียที่เป็นอันตรายต่อคนที่สำคัญที่สุด เกิดจากเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม ปัญหาสำคัญ ประการหนึ่งในการควบคุมและรักษาโรคนี้ เกิดจากการดื้อ ต่อยาที่ใช้รักษาแทบทุกชนิด วิธีหนึ่งที่จะช่วยแก้ไขปัญหา การดื้อยาของเชื้อมาลาเรียชนิดนี้คือ การค้นคว้าหายาชนิดใหม่ ที่มีประสิทธิภาพเพิ่มขึ้น และการเลือกหาเอนไซม์เป้าหมาย ใหม่ที่สามารถถูกยับยั้งการทำงานได้โดยยาชนิดนั้นแล้วมี ผลทำให้เชื้อมาลาเรียไม่สามารถเจริญเติบโตได้ ในการศึกษานี้ เอนไซม์ 2 ตัว ซึ่งเกี่ยวข้องกับ ขบวนการแบ่งตัวของดีเอนเอของเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม ได้ถูกนำมาศึกษา เอนไซม์ทั้งสองนี้ได้แก่ เอนไซม์ดีเอนเอ โทโปไอโซเมอเรส II และเอนไซม์ดีเอนเอโพลีเอเรสแกมมา เอนไซม์ดีเอนเอโทโปไอโซเมอเรส II ได้จากการสกัดโดย FPLC ด้วยการใช้ Econo Pac Q, heparin - agarose และ Mono Q column พบว่าสามารถแยกสกัดได้บริสุทธิ์ 3 เท่า และได้ปริมาณเอนไซม์บริสุทธิ์ 25% เมื่อวิเคราะห์ เอนไซม์ที่ได้โดยวิธี SDS-polyacrylamide gel electrophoresis พบว่าเอนไซม์ดีเอนเอโทโปไอโซเมอเรส II ของเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่มนี้ มีน้ำหนักโมเลกุล ประมาณ 160 กิโลดาลตัน ซึ่งอยู่ในช่วงเดียวกันกับเอนไซม์ ดีเอนเอโทโปไอโซเมอเรสที่สกัดจากเซลล์ eukaryotic ชนิดอื่น ๆ และ จากการศึกษาปฏิกิริยาระหว่างดีเอนเอ โทโปไอโซเมอเรสที่สกัดจากเซลล์ eukaryotic ชนิดอื่น ๆ และจากการศึกษาปฏิกิริยาระหว่างดีเอนเอโทโปไอโซเมอเรส II ที่สกัดจากเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม กับ Polyclonal antibody ดีเอนเอโทโปไอโซเมอเรส II ของคน พบว่า เอนไซม์ทั้งสองนี้มีความแตกต่างกันในส่วนของ C-terminal ส่วนการแยกสกัดเอนไซม์ ดีเอนเอ โพลีเมอเรสแกมมา โดย FPLC ด้วย column Econo Pac Q และ Mono S นั้น แม้ว่าเอนไซม์ดีเอนเอโพลีเมอเรส แกมมาซึ่งดื้อต่อ aphilicolin จะไม่สามารถแยกออกจากเอนไซม์ดีเอนเอโพลี- เมอเรสที่ไวต่อ aphilicolin แต่ยังคงพบว่ามีโปรตีนขนาด น้ำหนักโมเลกุล 150 kDa ปรากฎเด่นชัดขึ้นตามลำดับขั้นตอน การแยกสกัดเอนไซม์ และจากการศึกษาลำดับการเรียงตัวของ โปรตีนของเอนไซม์ ดีเอนเอโพลีเมอเรสแกมมาของเชื้อ พลาสโมเดียม ฟัลซิปารั่ม โดยวิธี automatic Edman degradation พบว่าทางด้าน N-terminal มีลำดับการเรียง ตัวของโปรตีน 9 ตัวแรกเป็น Met Glu Asn Lys Glu Lys Val Leu Asp (MENKEKVLD)