A study towards the development of a rapid diagnostic test to detect microbial specific nucleotide sequences
2
Issued Date
2023
Copyright Date
2008
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xviii, 121 leaves : ill.
Access Rights
restricted access
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (Ph.D. (Microbiology))--Mahidol University, 2008
Suggested Citation
Pakavadee Rakthong A study towards the development of a rapid diagnostic test to detect microbial specific nucleotide sequences. Thesis (Ph.D. (Microbiology))--Mahidol University, 2008. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/89541
Title
A study towards the development of a rapid diagnostic test to detect microbial specific nucleotide sequences
Alternative Title(s)
การศึกษาเพื่อนำไปสู่การพัฒนาชุดตรวจวิเคราะห์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่จำเพาะของจุลชีพ
Author(s)
Abstract
The aim of the present study was to prepare luminol encapsulated biotinylated liposomes to be used as generic signal generators capable of conjugation to biotinylated biomolecules. Liposome has been prepared using two types of biotinylated phospholipids: biotin.PEG2000disteroylphosphatidyl ethanolamine (B-PEG-DSPE) and biotin caproyl dipalmitoylphosphatidyl ethanolamine (B-Cap-DPPE) with luminol entrapped. These liposomes were characterized in terms of size, lamellarity, stability, and encapsulation efficiency. The length and chemical nature of spacers in the two biotinylated phospholipids and also the biotin ligand density were shown to affect the interaction of the liposome with soluble or immobilized streptavidin. The lysis of the liposome and the effects on the chemiluminescent reactions of liberated luminol by various detergents (SDS, Triton X-100 and deoxycholate (DOC)) were studied and DOC was shown to be the most suitable reagent. Using biotinylated 20-mer oligonucleotides (ONTs) as prototypes, the specific hybridization of the (+) and (-) strands of ONT immobilized on a microtiter plate were studied using streptavidin coated, luminol encapsulated biotinylated liposomes. It was found that the streptavidin coated liposome could specifically bind to the hybridized biotinylated ONTs and served as a signal generator. The hybridization was inhibited only by the corresponding ONT with the detection limit of 20 picomole. This streptavidin coated/luminal-encapsulated biotinylated liposome could serve as a versatile, generic signal generator capable of conjugation to, and for the detection of, biotinylated biomolecules.
วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือผลิตลิโปโซมที่มีลูมินอลซึ่งเป็นสารเรืองแสงเคมีอยู่ภายใน และมีกลุ่มไบโอตินบนผิวเพื่อใช้เป็นตัวให้สัญญาณในชุดตรวจวิเคราะห์ต่าง ๆ โดยลิโปโซมนี้ จะต้องสามารถจับกับสารชีวโมเลกุลที่มีไบโอตินเชื่อมอยู่ได้ ได้ทําการเตรียมลิโปโซมโดยใช้ ฟอสโฟลิปิดที่มีไบโอติน 2 ชนิดคือโพลีเอทธิลีนไกลคอล(2000) ไดสเตอริลฟอสฟทิดิลเอททาโนลามีน และคาโปรริลไดปามิโตอิลฟอสฟาทิดิลเอททาโนลามีน และทําการศึกษาคุณสมบัติต่าง ๆ ของลิโปโซมที่เตรียมได้ เช่น ขนาด,จํานวนชั้นของไขมัน, ความเสถียรและประสิทธิภาพในการเก็บลูมินอลไว้ภายใน พบว่าความยาวและชนิดของแขนที่อยู่ระหว่างหมู่ไบโอตินกับผิวลิโปโซมรวมทั้งความหนาแน่น ของกลุ่มไบโอตินบนผิวมีผลต่อการเกาะของลิโปโซมกับสเตปตาวิดินที่ถูกตรึงหรือที่ อยู่ใน สารละลาย ลิโปโซมที่มีสเตปตาวิดินทําปฏิกิริยาเคลือบอยู่บนผิวนี้ จะใช้เป็นตัวให้สัญญาณในชุด ตรวจต่าง ๆ นอกจากนี้ยังได้ทําการศึกษาผลของสารลดแรงตึงผิวต่าง ๆ (เอสดีเอส,ไตรตอนเอ็ก100 และดีออกซีโคเลท) ต่อการทําลายผิวของลิโปโซมเพื่อปลดปล่อยลูมินอลและผลต่อปฏิกิริยาของลิมินอลในการให้แสง ผลการศึกษาพบว่าดีออกซีโคเลท เหมาะสมที่สุด จากที่ใช้โอลิโกนิวคลีโอไทด์ ที่มีเบส 20 ตัวและมีสารไบโอตินติดฉลากอยู่เป็นต้นแบบ พบว่าการเกาะอย่างจําเพาะของสาย (-) และสาย (+) ที่ถูกตรึงบนผิวของไมโครไตเตอร์เพลท สามารถทําปฏิกิริยาอย่างจําเพาะกับลิโปโซม ที่มีสเตปตาวิดินเคลือบอยู่บนผิวได้และสามารถใช้เป็นตัวให้สัญญาณได้จริงนอกจากนี้ยังพบว่าการ เกาะของโอลิโกนิวคลีโอไทด์มความจําเพาะซึ่งถูกยับยั้บได้ด้วยโอลิโกนวคลีโอไทด์ที่มีลําคับเบส เดียวกันเข้ากัน โดยมีความไวในการวิเคราะห์ที่ 20x10-12 โมล ดังนั้นจึงสรุปได้ ว่าลิโปโซมที่มีลูมินอลอยู่ภายใน, มีไบโอตินอยู่ที่ผิวและเคลือบผิวด้วยสเตปตาวิดิน สามารถใช้เป็นตัวให้สัญญาณและ ใช้ตรวจหาชีวโมเลกุลที่มีไบโอตินติดฉลากอยู่ได้
วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือผลิตลิโปโซมที่มีลูมินอลซึ่งเป็นสารเรืองแสงเคมีอยู่ภายใน และมีกลุ่มไบโอตินบนผิวเพื่อใช้เป็นตัวให้สัญญาณในชุดตรวจวิเคราะห์ต่าง ๆ โดยลิโปโซมนี้ จะต้องสามารถจับกับสารชีวโมเลกุลที่มีไบโอตินเชื่อมอยู่ได้ ได้ทําการเตรียมลิโปโซมโดยใช้ ฟอสโฟลิปิดที่มีไบโอติน 2 ชนิดคือโพลีเอทธิลีนไกลคอล(2000) ไดสเตอริลฟอสฟทิดิลเอททาโนลามีน และคาโปรริลไดปามิโตอิลฟอสฟาทิดิลเอททาโนลามีน และทําการศึกษาคุณสมบัติต่าง ๆ ของลิโปโซมที่เตรียมได้ เช่น ขนาด,จํานวนชั้นของไขมัน, ความเสถียรและประสิทธิภาพในการเก็บลูมินอลไว้ภายใน พบว่าความยาวและชนิดของแขนที่อยู่ระหว่างหมู่ไบโอตินกับผิวลิโปโซมรวมทั้งความหนาแน่น ของกลุ่มไบโอตินบนผิวมีผลต่อการเกาะของลิโปโซมกับสเตปตาวิดินที่ถูกตรึงหรือที่ อยู่ใน สารละลาย ลิโปโซมที่มีสเตปตาวิดินทําปฏิกิริยาเคลือบอยู่บนผิวนี้ จะใช้เป็นตัวให้สัญญาณในชุด ตรวจต่าง ๆ นอกจากนี้ยังได้ทําการศึกษาผลของสารลดแรงตึงผิวต่าง ๆ (เอสดีเอส,ไตรตอนเอ็ก100 และดีออกซีโคเลท) ต่อการทําลายผิวของลิโปโซมเพื่อปลดปล่อยลูมินอลและผลต่อปฏิกิริยาของลิมินอลในการให้แสง ผลการศึกษาพบว่าดีออกซีโคเลท เหมาะสมที่สุด จากที่ใช้โอลิโกนิวคลีโอไทด์ ที่มีเบส 20 ตัวและมีสารไบโอตินติดฉลากอยู่เป็นต้นแบบ พบว่าการเกาะอย่างจําเพาะของสาย (-) และสาย (+) ที่ถูกตรึงบนผิวของไมโครไตเตอร์เพลท สามารถทําปฏิกิริยาอย่างจําเพาะกับลิโปโซม ที่มีสเตปตาวิดินเคลือบอยู่บนผิวได้และสามารถใช้เป็นตัวให้สัญญาณได้จริงนอกจากนี้ยังพบว่าการ เกาะของโอลิโกนิวคลีโอไทด์มความจําเพาะซึ่งถูกยับยั้บได้ด้วยโอลิโกนวคลีโอไทด์ที่มีลําคับเบส เดียวกันเข้ากัน โดยมีความไวในการวิเคราะห์ที่ 20x10-12 โมล ดังนั้นจึงสรุปได้ ว่าลิโปโซมที่มีลูมินอลอยู่ภายใน, มีไบโอตินอยู่ที่ผิวและเคลือบผิวด้วยสเตปตาวิดิน สามารถใช้เป็นตัวให้สัญญาณและ ใช้ตรวจหาชีวโมเลกุลที่มีไบโอตินติดฉลากอยู่ได้
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Microbiology
Degree Grantor(s)
Mahidol University