Investigating the expression of mutated pyruvate carboxylase of Rhizobium etli in Acetyl Coenzyme A Binding site
Issued Date
2015
Copyright Date
2015
Resource Type
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xiii, 88 leaves : ill.
Access Rights
open access
Rights
ผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้า
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 2015
Suggested Citation
Kamonman Choosangtong Investigating the expression of mutated pyruvate carboxylase of Rhizobium etli in Acetyl Coenzyme A Binding site. Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 2015. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/20.500.14594/94074
Title
Investigating the expression of mutated pyruvate carboxylase of Rhizobium etli in Acetyl Coenzyme A Binding site
Alternative Title(s)
การศึกษาการแสดงออกของเอ็นไซม์ไพรูเวทคาร์บอกซิเลสที่กลายพันธุ์ของไรโซเบียม เอทิลิในตำแหน่งการจับของแอซิทิล โคเอ็นไซม์เอ
Author(s)
Advisor(s)
Abstract
Pyruvate carboxylase (PC) is a biotin-dependent carboxylase enzyme catalysing the pyruvate carboxylation reaction to produce oxaloacetate with 2 partial reactions, MgATP- dependent carboxylation of biotin and the transfer of carboxyl group from carboxybiotin to pyruvate. PC is normally found as a tetramer with monomers of around 120-130 kDa in size. Each monomer contains 3 distinct functional domains which are biotin carboxylase (BC) domain, carboxyl transferase (CT) domain, and biotin carboxyl carrier protein (BCCP) domain. The recently found domain which mediates the tetramerization is PC tetramerization (PT) domain or allosteric domain. The previous study of residues in allosteric domain of PC from Rhizobium etli (RePC) (Arg427 and Arg472) indicated the important role of these residues in the allosteric regulation of PC. In this study, other residues in allosteric domain which directly interact with acetyl-CoA (Arg469 and Asp471) and indirectly interact with acetyl-CoA (Glu1027 and Asp1018) were examined the effects of these mutations on enzyme activity. R469S and R469K reduced the acetyl-CoA induced enzyme activity but less effect than R427 and R472 mutations. D471A completely destroyed the activity of enzyme activated by acetyl-CoA. E1027R caused decrease in enzyme activity induced by acetyl-CoA. All mutations increased in acetyl-CoA independent pyruvate carboxylation activity and ATP cleavage activity both in the presence and absence of acetyl-CoA. Results agree with previous studies that residues directly interacting with acetyl-CoA impact on the activation of enzyme by acetyl-CoA. Interaction between D1018 and R427 and the interaction between R469 and E360 only in subunit without acetyl-CoA bound support with previous studies that there is the transformation between the asymmetrical conformer and the symmetrical conformer during catalysis. Mutations of these residues may reduce the constraint of the enzyme and cause increase in catalytic activity in the absence of acetyl-CoA.
ไพรูเวทคาร์บอกซิเลสเป็นเอ็นไซม์ที่อาศัยไบโอตินซึ่งเร่งปฏิกิริยาเติมหมู่คาร์บอนให้ไพรูเวตเพื่อสร้างออกซาโลอะซิเตตด้วย 2 ปฏิกิริยาย่อยคือ การเติมหมู่คาร์บอนให้ไบโอตินโดยอาศัยแมกนีเซียมและการถ่ายหมู่คาร์บอนจากคาร์บอกซีไบโอตินไปยังไพรูเวท โดยปกติแล้วเอ็นไซม์อยู่ในรูปtetramerที่ประกอบด้วย monomer ขนาด120-130 kDa แต่ละmonomerประกอบด้วย 3 โดเมนที่ทำหน้าที่ต่างกันได้แก่ biotin carboxylase หรือ BC โดเมน, carboxyl transferase หรือ CT โดเมนและ biotin carboxyl carrier protein หรือBCCPโดเมน โดเมนที่เพิ่งถูกพบซึ่งช่วยในการ tetramerization เรียกว่า PC tetramerization โดเมน, PT โดเมน, หรือ allosteric โดเมน การศึกษาของresidue ใน allosteric โดเมนของไรโซเบียม เอทิลิ (RePC) ได้แก่ อาร์จินีน427 และ อาร์จินีน472 บ่งชี้ถึงหน้าที่สำคัญต่อการควบคุมแบบอะโลสเตอริก (allosteric regulation) ของเอนไซม์ ในงานวิจัยนี้ได้ศึกษา residue ตัวอื่นใน allosteric โดเมนที่จับกับแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอโดยตรง ได้แก่ อาร์จินีน469 และ แอสพาเตท471 และทางอ้อมได้แก่ กลูตาเมท1027 และ แอสพาเตท1018 ในผลของการกลายพันธุ์ต่อการทำงานของเอ็นไซม์ R469S และ R469K ลดการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อถูกกระตุ้นโดยแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอแต่ไม่มากเท่า R427 และ R472 ที่กลายพันธุ์ D471A ได้ทำลายการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อถูกกระตุ้นโดยแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ E1027R ลดการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อถูกกระตุ้นโดยแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ เอ็นไซม์ที่กลายพันธุ์ทุกตัวเพิ่มการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อไม่มีแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ และ เพิ่มการสลายเอทีพีทั้งที่มีและไม่มีแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ ผลการทดลองได้สนับสนุนการศึกษาก่อนหน้านี้ว่า residue ที่จับกับแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอโดยตรงมีผลต่อการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อถูกกระตุ้นโดยแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ การจับกันของ D1018 กับ R427 และ R469 กับ E360 ในหน่วยย่อยของเอ็นไซม์ที่ไม่มีแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอจับเท่านั้นสนับสนุนการศึกษาก่อนหน้านี้ว่าเอ็นไซม์มีการเปลี่ยนโครงสร้างจากอสมมาตรไปเป็นสมมาตรระหว่างเกิดปฏิกิริยา การกลายพันธุ์ของ residue เหล่านี้อาจไปลดการควบคุมการทำงานของเอ็นไซม์ทำให้เพิ่มการ ทำงานของเอ็นไซม์เมื่อไม่มีแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ
ไพรูเวทคาร์บอกซิเลสเป็นเอ็นไซม์ที่อาศัยไบโอตินซึ่งเร่งปฏิกิริยาเติมหมู่คาร์บอนให้ไพรูเวตเพื่อสร้างออกซาโลอะซิเตตด้วย 2 ปฏิกิริยาย่อยคือ การเติมหมู่คาร์บอนให้ไบโอตินโดยอาศัยแมกนีเซียมและการถ่ายหมู่คาร์บอนจากคาร์บอกซีไบโอตินไปยังไพรูเวท โดยปกติแล้วเอ็นไซม์อยู่ในรูปtetramerที่ประกอบด้วย monomer ขนาด120-130 kDa แต่ละmonomerประกอบด้วย 3 โดเมนที่ทำหน้าที่ต่างกันได้แก่ biotin carboxylase หรือ BC โดเมน, carboxyl transferase หรือ CT โดเมนและ biotin carboxyl carrier protein หรือBCCPโดเมน โดเมนที่เพิ่งถูกพบซึ่งช่วยในการ tetramerization เรียกว่า PC tetramerization โดเมน, PT โดเมน, หรือ allosteric โดเมน การศึกษาของresidue ใน allosteric โดเมนของไรโซเบียม เอทิลิ (RePC) ได้แก่ อาร์จินีน427 และ อาร์จินีน472 บ่งชี้ถึงหน้าที่สำคัญต่อการควบคุมแบบอะโลสเตอริก (allosteric regulation) ของเอนไซม์ ในงานวิจัยนี้ได้ศึกษา residue ตัวอื่นใน allosteric โดเมนที่จับกับแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอโดยตรง ได้แก่ อาร์จินีน469 และ แอสพาเตท471 และทางอ้อมได้แก่ กลูตาเมท1027 และ แอสพาเตท1018 ในผลของการกลายพันธุ์ต่อการทำงานของเอ็นไซม์ R469S และ R469K ลดการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อถูกกระตุ้นโดยแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอแต่ไม่มากเท่า R427 และ R472 ที่กลายพันธุ์ D471A ได้ทำลายการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อถูกกระตุ้นโดยแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ E1027R ลดการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อถูกกระตุ้นโดยแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ เอ็นไซม์ที่กลายพันธุ์ทุกตัวเพิ่มการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อไม่มีแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ และ เพิ่มการสลายเอทีพีทั้งที่มีและไม่มีแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ ผลการทดลองได้สนับสนุนการศึกษาก่อนหน้านี้ว่า residue ที่จับกับแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอโดยตรงมีผลต่อการทำงานของเอ็นไซม์เมื่อถูกกระตุ้นโดยแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ การจับกันของ D1018 กับ R427 และ R469 กับ E360 ในหน่วยย่อยของเอ็นไซม์ที่ไม่มีแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอจับเท่านั้นสนับสนุนการศึกษาก่อนหน้านี้ว่าเอ็นไซม์มีการเปลี่ยนโครงสร้างจากอสมมาตรไปเป็นสมมาตรระหว่างเกิดปฏิกิริยา การกลายพันธุ์ของ residue เหล่านี้อาจไปลดการควบคุมการทำงานของเอ็นไซม์ทำให้เพิ่มการ ทำงานของเอ็นไซม์เมื่อไม่มีแอซิทิลโคเอ็นไซม์เอ
Description
Biochemistry (Mahidol University 2015)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Biochemistry
Degree Grantor(s)
Mahidol University