Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate bioplastic from glycerol by engineered Escherichia coli

Abstract

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are potentially used as bio-plastics. However, the high cost of PHAs limits their use in the commodity market. Crude glycerol is an alternative carbon source for PHAs production. Engineered Escherichia coli strains were constructed to investigate their ability to synthesize poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)] and Short-Chain-Length-co-Medium-Chain-Length PHAs (SCL-MCL-PHAs) from pure and crude glycerol. PHA biosynthesis-related genes: ß-ketothiolase (phaA), acetoacetyl-CoA reductase (phaB) and PHA synthase (phaC), were cloned into pETDuet-ABCs and co-expressed in E. coli for P(3HB) biosynthesis. The phaA and phaB genes were derived from Ralstonia eutropha whereas 3 different phaCs from 3 different bacteria (Aeromonas hydrophila, R. eutropha and Pseudomonas putida) were used. The results showed that the amount of P(3HB) is affected by the type of PhaCs (30 wt%, 24 wt%, and 2 wt% of cell dry weight (CDW), respectively). The stage of cell and the carbon: nitrogen ratio were also found to be the key parameters influencing the amount of P(3HB). To produce SCL-MCL-PHAs, three (R)-specific enoyl-CoA hydratase genes from P. putida (phaJ1[subscript]Pp and phaJ4[subscript]Pp) and from A. hydrophila (phaJ[subscript]Ah) were cloned into pCDFDuet-Js and co-transformed with pETDuet-ABCs. Co-expression of PhaAB with each of PhaCs and PhaJs caused E. coli to produce SCL-MCL-PHAs with different monomer compositions, varying from C4 to C10 from pure glycerol supplemented with dodecanoate. The fractions of MCL-unit were in correlation with the concentration of dodecanoate. When 1% crude glycerol was used as a carbon source, E. coli-ABCAh produced P(3HB) at 14 wt% of CDW; whereas E. coli-ABCAhJAh produced P(3HB-1 mol% 3HHx) at 3 wt% of CDW when dodecanoate was included in the culture media. The molecular weight of PHAs produced was in the range of 110 to 260 kDa and the thermal properties of P(3HB-co-3HHx) were superior to P(3HB).

ยังถูกจากัดด้วยราคาที่สูง กลีเซอรอลดิบคือแหล่งคาร์บอนทางเลือกสาหรับการผลิต PHAs Escherichia coli ดัดแปลงหลายสายพันธุ์จึงถูกสร้างขึ้นเพื่อศึกษาความสามารถในการผลิต poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)] และ Short-Chain-Length-co-Medium-Chain-Length PHAs (SCL-MCL-PHAs) จากกลีเซอรอลบริสุทธิ์และกลีเซอรอลดิบ โดยยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิต PHA ได้แก่ ß-ketothiolase (phaA) acetoacetyl-CoA reductase (phaB) และ PHA synthase (phaC) ถูกโคลนเข้า pETDuet-ABCs และถูกเหนี่ยวนาให้แสดงออกร่วมกันใน E. coli เพื่อผลิต P(3HB) โดยที่ยีน phaA และ phaB มาจาก Ralstonia eutropha ในขณะที่ phaCs 3 ชนิด มาจากแบคทีเรีย 3 ชนิดคือ Aeromonas hydrophila R. eutropha และ Pseudomonas putida ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าชนิดของ phaCs ส่งผลต่อปริมาณของ P(3HB) ที่ผลิตได้ (30% 24% และ 2% ของน้าหนักเซลล์แห้งตามลาดับ) ระยะของเซลล์และสัดส่วนระหว่างคาร์บอนและไนโตรเจนในอาหารเลี้ยงมีผลต่อปริมาณ P(3HB) เช่นกัน และเพื่อที่จะผลิต SCL-MCL-PHAs จึงโคลนยีน (R)-specific enoyl-CoA hydratase 3 ชนิด จาก P. putida (phaJ1[subscript]Pp and phaJ4[subscript]Pp) และ A. hydrophila (phaJ[subscript]Ah) เข้า pCDFDuet-Js และส่งถ่ายพร้อมกับ pETDuet-ABCs พบว่าการแสดงออกร่วมกันของ PhaAB กับแต่ละชนิดของ PhaCs และ PhaJs ทาให้ E. coli ผลิต SCL-MCL-PHAs ที่ประกอบด้วยโมโนเมอร์ที่มีจานวนคาร์บอนตั้งแต่ 4 ถึง 10 อะตอมจากการใช้กลีเซอรอล บริสุทธิ์ร่วมกับโดเดกคาร์โนเอต และสัดส่วนของโมโนเมอร์สัมพันธ์กับความเข้มข้นของโดเดกคาร์โนเอต นอกจากนี้เมื่อกลีเซอรอลดิบถูกใช้เป็นแหล่งคาร์บอน พบว่า E. coli-ABCAh ผลิต P(3HB) ได้ 14% ของน้าหนักเซลล์แห้ง ในขณะที่ E. coli-ABC[subscript]AhJ[subscript]Ah ผลิต P(3HB-1 mol% 3HHx) ได้ 3% ของน้าหนักเซลล์แห้งเมื่อมีการเติม โดเดกคาร์โนเอตลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ น้าหนักโมเลกุลของ PHAs ที่ได้อยู่ในช่วง 110 ถึง 260 กิโลดาร์ลตัน และ P(3HB-co-3HHx) แสดงคุณสมบัติด้านความร้อนที่ดีกว่า P(3HB)