Characterization of HPV16 oncogenes : genetic variation, localization and transactivation function

Abstract

Cervical cancer is the most common cancer in Thai women. Of the causes of cervical cancer, an infection of HPV16 ranks highest in clinical samples. Overexpression of E6 and E7 oncogenes following viral integration results in the interference of host homeostasis. The functions of viral proteins in modulating apoptosis leading to drug resistance are of special interest as it affects the treatment outcome. HPV infection in 82 Thai invasive cervical cancers was investigated. HPV16 was the most common type, found in 57.3% of the samples. Characterization of HPV16 E6 sequences grouped the variations into 5 subtypes, of which the most prevalent, found in 58.1% of samples, was an alteration of T to G at nucleotide position 178. Identification of E7 mutations showed that the mutation at nucleotide position 647, a change of A to G, was the most frequent. Interestingly, co-mutation of these two most common mutants of E6 and E7 was predominantly found in cervical cancers that were studied suggesting its functional significance. Notably, this co-mutation was first reported in this study. The effect of HPV16 oncoproteins on the transcription activation of an antiapoptotic gene, Bcl-xL, was also studied. No clear correlations were observed between the expression of HPV16 oncogenes and Bcl-xL gene in transiently transfected cells. However, when the assay was performed in C33a cells stably transfected with HPV16 oncogenes; E6*I (splice form of E6), E6 or E7 gene, the increases of both Bcl-xL transcript and protein were evident in all stable cells expressing HPV16 oncogenes. Yet, the increased level of Bcl-xL protein could not rescue the transfected cells from apoptosis induced by etoposide. Study on protein localization revealed that E6 was dispersed throughout cells, but was predominantly found in the nucleus. A similar result was seen with E6*I whereas E6MT (unsplice variant of E6) localized mainly in the nucleus. None of these HPV oncoproteins were found in the nucleoli. Co-localizations of E6 and E6AP (E6 associated protein; ubiquitin ligase enzyme) as well as E6*I and E6AP were mainly in the cytoplasm, rarely in the nucleus. On the other hand, E6MT rarely co-localized with E6AP in the nucleus and perinuclear region. These differential localizations implied a role of E6*I protein in interfering with E6-E6AP binding. Taken together, genetic variation, transcription function and protein localization of HPV oncogenes have been described in this study. The results indicate the importance of co-mutation variant of E6 and E7 genes and the functional relevance of E6*I protein in modulating host homeostasis.

มะเร็งปากมดลูกเป็นมะเร็งที่พบมากที่สุดในผู้หญิงไทย จากสาเหตุส่วนใหญ่ของมะเร็งปากมดลูกการติดเชื้อ ของ HPV16 จะพบได้มากที่สุดในตัวอย่างจากคลินิก การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของยีนมะเร็ง E6 และ E7 หลังการ แทรกตัวของยีนไวรัสส่งผลรบกวนสมดุลของเจ้าบ้าน ทั้งนี้หน้าที่ของโปรตีนจากไวรัสในการรบกวนการตาย ซึ่ง อาจส่งผลให้เกิดการดื้อยา เป็นจุดที่น่าสนใจเป็นพิเศษ เนื่องจากจะส่งผลต่อผลการรักษา การติดเชื้อ HPV ใน 82 มะเร็งปากมดลูกชนิดลุกลามจากคนไทย พบการติดเชื้อ HPV16 มากที่สุดใน 57.3% ของตัวอย่าง ความหลากหลายของยีน E6 ของ HPV16 จัดกลุ่มได้เป็น 5 ชนิดย่อย ซึ่งชนิดที่พบมากที่สุดใน 58.1% ของตัวอย่างคือการเปลี่ยนแปลงนิวคลิโอไทด์จาก T เป็น G ที่ตำแหน่ง 178 การศึกษาการเปลี่ยนแปลง ลำดับของ E7 พบว่าการเปลี่ยนนิวคลิโอไทด์ที่ตำแหน่ง 647 จาก A เป็น G พบมากที่สุด เป็นที่น่าสนใจว่าการ เปลี่ยนแปลงร่วมกันของยีน E6 และ E7 แบบที่พบมากนี้ ตรวจพบได้บ่อยครั้งในมะเร็งปากมดลูกจากคนไข้ไทย ชี้ให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงร่วมกันนี้มีบทบาทสำคัญ เป็นที่น่าสังเกตว่าการเปลี่ยนแปลงร่วมกันของยีน E6 และ E7แบบนี้ถูกรายงานในการศึกษานี้เป็นครั้งแรก การศึกษาผลของการเพิ่มโปรตีนมะเร็งของ HPV16 ต่อการแสดงออกของยีน Bcl-xL ถูกศึกษาแต่ไม่พบ ความสัมพันธ์อย่างชัดเจนระหว่างการแสดงออกของยีนมะเร็งของไวรัส HPV และ Bcl-xL ในการนำยีนเข้าแบบ ชั่วคราว แต่เมื่อทดสอบในเซลล์ C33a ที่แสดงออกยีน E6*I (E6 ที่ถูกตัดออก), E6 หรือ E7 แบบถาวร พบการ เพิ่มขึ้นของผลผลิตของยีน Bcl-xL และโปรตีน Bcl-xL ในทุกเซลล์ที่แสดงออกยีนของไวรัส HPV แบบถาวร อย่างไรก็ตามโปรตีน Bcl-xL ที่เพิ่มขึ้นไม่สามารถช่วยเซลล์ให้รอดจากการตายที่กระตุ้นโดยยา etoposide เมื่อศึกษาแหล่งที่อยู่ของโปรตีนพบว่า E6 พบกระจายทั่วทั้งเซลล์โดยพบมากเป็นพิเศษที่นิวเคลียส ผลการ ทดลองที่คล้ายกันนี้พบในเซลล์ที่สร้าง E6*I แต่ E6MT (E6 ที่ไม่ถูกตัด) พบเด่นชัดที่นิวเคลียส ไม่มีโปรตีน มะเร็งของ HPV ใดที่พบอยู่ที่ nucleoli มีแต่ตัวควบคุม GFP การอยู่ร่วมกันของ E6 และ E6AP เช่นเดียวกับ E6*I และ E6AP พบมากที่ไซโทพลาสซึมพบน้อยที่นิวเคลียส ซึ่งแตกต่างจาก E6MT ที่พบอยู่ร่วมกับ E6AP น้อยที่นิวเคลียสและรอบๆ ความแตกต่างของแหล่งที่อยู่แสดงนัยถึงหน้าที่ของโปรตีน E6*I ในการรบกวนการ เกาะกันของ E6 และ E6AP เมื่อรวมเข้าด้วยกัน การทดลองนี้แสดงความหลากหลายของยีน, หน้าที่กระตุ้นการแสดงออกของยีนและ แหล่งที่อยู่ของยีนมะเร็งของ HPV ผลการทดลองเสนอว่าการผิดปกติร่วมของยีน E6 และยีน E7 น่าจะมี ความสำคัญ และยังชี้ให้เห็นถึงหน้าที่ของโปรตีน E6*I ที่เกี่ยวข้องในการควบคุมหน้าที่ของโปรตีนเจ้าบ้าน