Manipulation of Escherichia Coli Genome to generate a multi-functional strain for DNA cloning and protein expression
5
Issued Date
2018
Copyright Date
2018
Resource Type
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xvii, 114 leaves : ill.
Access Rights
open access
Rights
ผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้า
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 2018
Suggested Citation
Manadsaree Klomtun Manipulation of Escherichia Coli Genome to generate a multi-functional strain for DNA cloning and protein expression. Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 2018. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/92291
Title
Manipulation of Escherichia Coli Genome to generate a multi-functional strain for DNA cloning and protein expression
Alternative Title(s)
การดัดแปลงจีโนมของอีโคไลเพื่อสร้างพันธุ์เอนกประสงค์สำหรับการโคลนดีเอ็นเอและการผลิตโปรตีน
Author(s)
Abstract
Genome modifications of several E. coli strains have been done for many specific purposes, such as for DNA cloning and gene expression. Recently, multifunctional strains were constructed in which blue/white screening to select cloned gene, simultaneously with tight regulation for protein expression can be performed. Unfortunately, the lacIq promoter carried by those strains is not sufficient to minimize leaky transcription when using pUC-based plasmids. To overcome this problem, we constructed a new multifunctional E. coli strain which contains all of the essential properties for DNA cloning and protein expression, but in which the leaky transcription is completely controlled. The ability to perform in vivo homologous cloning was conserved from the parental strain, the lacIq1ΔZM15 genotype was modified and a T7 RNA polymerase was added. In this study, the genome of the K-12 strain DH10B was modified using the λ red recombination system in which the selectable and counter-selectable markers were incorporated. After successful modification, the new strain DH10B3054 exhibited tight control of gene transcription under a lac promoter in pUC-based plasmids as demonstrated by its superior resistance to a lethal gene, ndd. The α-complementation could be achieved by deletion of the residue 2-42 in the lacZ gene. However, the new strain showed lower complementation of β-galactosidase. Unfortunately, the T7-based system was unable to control gene expression, leading to severe leaky expression of the egfp gene, although such expression could still be controlled by glucose. Furthermore, in contrast to the parental DH10B strain the new strain was unable to perform in vivo cloning, in spite of no significant changes being detected in other parts of its genome. These unexpected results might be considered in the future for reconstruction of the gene cassettes to further improve bacterial cell properties for specific purposes.
สายพันธุ์ของแบคทีเรีย E. coli โดยส่วนใหญ่ในปัจจุบันเกิดจากการดัดแปลงจีโนมเพื่อประโยชน์ในการโคลนดีเอ็นเอและผลิตโปรตีน ซึ่ง E. coli เหล่านี้มีคุณสมบัติในการคัดเลือกโคลนดีเอ็นเอโดยวิธีคัดเลือกโคโลนีน้ำเงินหรือขาว (blue/white screening) และป้องกันการแสดงออกของยีนก่อนเวลาที่เหมาะสม อย่างไรก็ตามสายพันธุ์ของ E. coli ที่มีในปัจจุบันยังมีคุณสมบัติไม่เพียงพอต่อการควบคุมแสดงออกยีนจากพลาสมิดที่มีหลายโมเลกุลต่อเซลล์ (pUC-based plasmid) เพื่อปรับปรุงคุณสมบัติดังกล่าวผู้วิจัยจึงคิดสร้าง E. coli สายพันธุ์ใหม่ที่มีคุณสมบัติเป็นพันธุ์อเนกประสงค์เพิ่มเติมจากที่กล่าวมาข้างต้นกล่าวคือสามารถผลิตโปรตีนโดยใช้ T7 RNA polymerase รวมถึงควบคุมการแสดงออกของยีนจาก pUCbased plasmid และเชื่อมชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการเข้ากับดีเอ็นเอพาหะได้ในเซลล์ (in vivo cloning) หลังจากทำการดัดแปลงโครโมโซมเสร็จสิ้นโดยใช้ระบบของไวรัส λ ทำให้ E. coli สายพันธุ์ใหม่ (DH10B3054) ที่ได้สามารถควบคุมการแสดงออกของยีนได้เป็นอย่างดีใน pUC-based plasmid แต่ยีนนั้น ต้องแสดงออกผ่าน lac promoter ไม่ใช่ T7 promoter แบคทีเรียยังคงความสามารถในการคัดเลือกโคลนดี เอ็นเอโดย blue/white screening ได้ แต่การแสดงออกของยีนที่ให้เอนไซม์ β-galactosidase ต่ำลง นอกจากนี้ความต่างทางด้านส่วนประกอบของจีโนมทำให้ปริมาณโปรตีนที่ผลิตได้ในสายพันธุ์ใหม่โดยใช้ T7 RNA polymerase น้อยกว่าใน BL21(DE3) อย่างไรก็ตาม DH10B3054 สูญเสียความสามารถในการทำ in vivo cloning โดยที่ไม่พบความเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในส่วนอื่นของจีโนม จึงยังไม่มีเหตุผลอธิบายแน่ชัดว่าเป็นเพราะสาเหตุใดและจำเป็นต้องมีการศึกษาต่อไปในอนาคตหรือปรับปรุงชุดยีนใหม่เพื่อปรับปรุงสาย พันธุ์ให้ดียิ่งขึ้น
สายพันธุ์ของแบคทีเรีย E. coli โดยส่วนใหญ่ในปัจจุบันเกิดจากการดัดแปลงจีโนมเพื่อประโยชน์ในการโคลนดีเอ็นเอและผลิตโปรตีน ซึ่ง E. coli เหล่านี้มีคุณสมบัติในการคัดเลือกโคลนดีเอ็นเอโดยวิธีคัดเลือกโคโลนีน้ำเงินหรือขาว (blue/white screening) และป้องกันการแสดงออกของยีนก่อนเวลาที่เหมาะสม อย่างไรก็ตามสายพันธุ์ของ E. coli ที่มีในปัจจุบันยังมีคุณสมบัติไม่เพียงพอต่อการควบคุมแสดงออกยีนจากพลาสมิดที่มีหลายโมเลกุลต่อเซลล์ (pUC-based plasmid) เพื่อปรับปรุงคุณสมบัติดังกล่าวผู้วิจัยจึงคิดสร้าง E. coli สายพันธุ์ใหม่ที่มีคุณสมบัติเป็นพันธุ์อเนกประสงค์เพิ่มเติมจากที่กล่าวมาข้างต้นกล่าวคือสามารถผลิตโปรตีนโดยใช้ T7 RNA polymerase รวมถึงควบคุมการแสดงออกของยีนจาก pUCbased plasmid และเชื่อมชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการเข้ากับดีเอ็นเอพาหะได้ในเซลล์ (in vivo cloning) หลังจากทำการดัดแปลงโครโมโซมเสร็จสิ้นโดยใช้ระบบของไวรัส λ ทำให้ E. coli สายพันธุ์ใหม่ (DH10B3054) ที่ได้สามารถควบคุมการแสดงออกของยีนได้เป็นอย่างดีใน pUC-based plasmid แต่ยีนนั้น ต้องแสดงออกผ่าน lac promoter ไม่ใช่ T7 promoter แบคทีเรียยังคงความสามารถในการคัดเลือกโคลนดี เอ็นเอโดย blue/white screening ได้ แต่การแสดงออกของยีนที่ให้เอนไซม์ β-galactosidase ต่ำลง นอกจากนี้ความต่างทางด้านส่วนประกอบของจีโนมทำให้ปริมาณโปรตีนที่ผลิตได้ในสายพันธุ์ใหม่โดยใช้ T7 RNA polymerase น้อยกว่าใน BL21(DE3) อย่างไรก็ตาม DH10B3054 สูญเสียความสามารถในการทำ in vivo cloning โดยที่ไม่พบความเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในส่วนอื่นของจีโนม จึงยังไม่มีเหตุผลอธิบายแน่ชัดว่าเป็นเพราะสาเหตุใดและจำเป็นต้องมีการศึกษาต่อไปในอนาคตหรือปรับปรุงชุดยีนใหม่เพื่อปรับปรุงสาย พันธุ์ให้ดียิ่งขึ้น
Description
Biochemistry (Mahidol University 2018)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Biochemistry
Degree Grantor(s)
Mahidol University