Studies of lipase expressed in E.coli from a cloned gene of a thermophilic bacterium and from a synthetic gene of pseudomonas fragi
5
Issued Date
2024
Copyright Date
1996
Resource Type
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xxiii, 201 leaves : ill.
Access Rights
open access
Rights
ผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้า
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 1996
Suggested Citation
Sittiruk Roytrakul Studies of lipase expressed in E.coli from a cloned gene of a thermophilic bacterium and from a synthetic gene of pseudomonas fragi. Thesis (M.Sc. (Biochemistry))--Mahidol University, 1996. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/99290
Title
Studies of lipase expressed in E.coli from a cloned gene of a thermophilic bacterium and from a synthetic gene of pseudomonas fragi
Alternative Title(s)
การศึกษาไลเปสจากแบคทีเรียทนความร้อนและจากการโคลนยีนสังเคราะห์ของไลเปสจาก Pseudomonas fragi ในเชื้อ E.coli
Author(s)
Abstract
The gene encoding extracellular lipase-producing thermophile, TL71, has been constructed and expressed in Escherichia coli by using pUC18 expression vector with the lacZ promoter. The pUCTL71-1 clone secreted highly active lipase in the cultivation medium. The extracellular lipase was purified from the supernatant by sequential column chromatography on Phenyl Sepharose CL-4B and DEAE-cellulose (DE-52). The final product, a protein with an Mr of 38,000 by SDS-PAGE, was purified nearly 276-fold from the original cell-free supernatant in a yield of about 69% and the specific activity of the purified enzyme was 11,452 unit/mg protein. SDS-PAGE and lipase activity stained gel (zymogram) of purified lipase revealed one enzymatically active protein band corresponding to a molecular weight of 38,000 Da indicating that the enzyme was catalytically competent as a monomer, The single subunit of lipase was capable of aggregation as indicated by presence of >100,000 Da protein on Sephadex G-100 gel filtration and exhibited lipase activity as measured with the insoluble substrate, olive oil, and with soluble substrate, p-nitrophenyl palmitate. The isoelectric point of the lipase, as determined by means of isoelectric focusing, was found to be 7.75. The enzyme had an optimum temperature of 45 degree C, when olive oil was used as the substrate. It was stable at a broad pH range of 8 to 12. The enzyme retained 65% of its total activity even after incubation at 55 degree C for 5 days. Rapid loss of enzyme activity was observed above 68 degree C. Lipase activity was inhibited by 17% in the presence of 10 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and was not inhibited by 10 mM of the chelating agent ethylenediaminetetraacetate (EDTA), indicating the possible involvement of a serine residue in the active site of this enzyme. The lipase was neither inhibited by 10 mM ethyleneglycol-bis[-aminoethylether]-N, N, N, N-tetraacetic acid (EGTA) nor activated by 10 mM calcium chloride suggesting that a calcium binding site did not exist. Enzyme activity was significantly enhanced 2-fold by 4%Triton X-100 and 3M urea, and strongly inhibited by 1% and greater of sodium dodecylsulfate (SDS). Based on the known (135 residues) amino acid sequences of Pseudomonas fragi IF03458 lipase, a 434 bp gene was designed, and assembled from eight synthetic overlapping DNA fragments. The JPLipl construct was found to contain a number of errors. This synthetic gene was therefore corrected. The resulting construct, JPLip2, has the same nucleotide sequence as JPLip 1, except two point mutations at base position 156 (A to G) and at base position 172 (T to A). For expression in bacteria, the lipaseencoding gene (JPLip2) was inserted into the lacZ gene fragment contained in the small expression vector, pBluescript SK+, and cloned into the Escherichia coli JM109. Expression of this construct yielded a protein approximately 19,000 in size, equivalent to expected protein, with an Mr of 14,643, plus 43 additional amino acids of β-galactosidase at the N-terminus. It was found that the high-level expression of this synthetic gene in E.coli JM109 resulted in its cytoplasmic deposition as biologically inactive and insoluble inclusion bodies, equivalent to 12 % of total cell protein. The expressed lipase was solubilized from inclusion bodies using either 6 M guanidinium hydrochloride (GuHCl), 8 M urea or by a cationic detergent, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). The refolding efficiency resulting in final yield of purified expressed lipase was in the order of CTAB > urea > GuHCl. The refolded JPLip2 lipase also showed 3.7-fold greater lipolytic activity than that of native Pseudomonas fragi IF03458 lipase.
ยีนสำหรับสร้างเอ็นไซม์ไลเปสจากแบคทีเรียทนความร้อน สายพันธุ์ TL71 ถูกตัดต่อเชื่อมกับดีเอ็นเอพาหะ pUC18 และถูกแสดงออกในเชื้อแบคทีเรียชนิด Escherichia coli พบว่าโคลน pUCTL71-1 สามารถสร้างเอ็นไซม์ไลเปสและหลั่ง ออกมานอกเซลล์สะสมในอาหารเลี้ยงเชื้อปริมาณสูง วิทยานิพนธ์นี้กล่าวถึงการทำให้เอ็นไซม์นี้บริสุทธิ์โดย ผ่านอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเอ็นไซม์สะสมอยู่ลงในคอลัมน์ ฟินิลเซฟาโรสซีแอลสี่บี และคอมลัมน์ดีอีเออีเซลลูโลส ตามลำดับ ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า เอ็นไซม์ไลเปสมีความ บริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 276 เท่า มีปริมาณ activity หลงเหลือ เป็น 68.8% และมี specific activity เท่ากับ 11,452 ยูนิต ต่อมิลลิกรัมโปรตีน เมื่อทำการศึกษาขนาดของเอ็นไซม์นี้ โดยใช้คอลัมน์เซฟาเด็กซ์จี 100 พบว่ามีขนาดใหญ่กว่า 100,000 ดาลตัน แต่มีขนาด 38,000 ดาลตัน เมื่อทำการวิ่ง วุ้นโพลีอะคริละไมด์ที่มี SDS เป็นส่วนประกอบ และยังค้นพบ ต่อไปอีกว่า แถบโปรตีนขนาด 38,000 ดาลตันที่ได้หลังการ วิ่งวุ้นโพลีอะคริละไมด์เท่านั้นจึงจะแสดงสมบัติของ เอ็นไซม์ไลเปสหลังจากกำจัด SDS ออกจากแผ่นวุ้นแล้ว จึงสรุปได้ว่าเอ็นไซม์ไลเปสเป็น โมเลกุลเดี่ยวที่มีขนาด 38,000 ดาลตัน ซึ่งจะเกาะกลุ่มกันเป็นก้อนขนาดใหญ่กว่า 100,000 ดาลตัน ในภาวะที่ไม่มี SDS อย่างไรก็ตามเอ็นไซม์นี้ ยังคงแสดงสมบัติของเอ็นไซม์ไลเปส โดยการย่อยโมเลกุลของ สับสเตรทชนิดน้ำมันมะกอกหรือ p-NPP ทั้งเอ็นไซม์ที่ อยู่ในรูปโมเลกุลเดี่ยวหรือเกาะกลุ่มกันเป็นก้อน นอกจาก นี้ยังพบว่า เอ็นไซม์นี้มีค่า pl เท่ากับ 7.75 และเสถียร ในช่วง pH 8-12 ส่วนผลของอุณหภูมิพบว่า เอ็นไซม์นี้ เกิดปฏิกริยาได้ดีที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียสและทนที่ อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลากว่า 5 วัน โดยยังคงมี activity เหลืออยู่สูงถึง 65% แต่ activity ของเอ็นไซม์ จะลดลงอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูงกว่า 68 องศาเซลเซียส และเมื่อทำการศึกษาผลของสารเคมีต่อ activity ของเอ็นไซม์ พบว่า activity ของเอ็นไซม์จะลดลง 17% เมื่อมี PMSF อยู่เป็นปริมาณ 10 mM ต่อ EDTA ที่ความเข้มข้น 10 mM ไม่มีผลต่อ activity ของเอ็นไซม์เลย แสดงว่ากรดอะมิโนเซรี อาจเกี่ยวข้องกับ active site ของเอ็นไซม์ และไม่ว่า EGTA หรือ CaCl(,2) ที่ความเข้มข้น 10 mM ก็ไม่มีผลต่อ activity ของเอ็นไซม์ ผลการทดลองนี้ชี้ให้เห็นว่า เอ็นไซม์ไลเปสนี้ไม่มีส่วนจับแคลเซียมประกอบในโมเลกุล นอกจากนี้ยังมีผลการทดลองที่แสดงว่า activity ของเอ็นไซม์ จะเพิ่มขึ้นประมาณ 2 เท่า เมื่อมี 4% Triton X-100 หรือ 3M ยูเรียผสมอยู่ และ activity ของเอ็นไซม์จะลดลงทันทีที่ มี SDS เข้มข้นมากว่า 1% สายยีนสังเคราะห์สำหรับเอ็นไซม์ไลเปส (JPLip1) ได้ถูกออกแบบและสังเคราะห์ขึ้นโดยมีพื้นฐานจากลำดับ กรดอะมิโนของเชื้อซูโดโมแนสฟราจี สายพันธุ์ IFO 3458 แต่จากการตรวจสอบพบว่า ลำดับเบสบนสายยีนสังเคราะห์ ดังกล่าวยังมีความผิดพลาดอยู่ วิทยานิพนธ์นี้จึงกล่าวถึง การซ่อมแซมสายยีนสังเคราะห์ JPLip 1 จนกระทั่งได้สายยีน สังเคราะห์ JPLip 2 ที่มีลำดับเบสเหมือนกับ JPLip 1 เว้นแต่มีการกลายของเบสที่ตำแหน่ง 156 จาก A เป็น G และตำแหน่ง 172 จาก T เป็น A ซึ่งการกลายดังกล่าวไม่มี ผลกระทบต่อลำดับกรดอะมิโนของเอนไซม์ตามที่ออกแบบไว้แต่แรก สายยีนสังเคราะห์ JPLip 2 สามารถผลิตโปรตีนในเชื้อ แบคทีเรียเจ้าบ้านชนิด Escherichia coli สายพันธ์ jM 109 ภายใต้การควบคุมของยีน lac Z ที่เป็นส่วนหนึ่งของดีเอ็นเอ พาหะ pBluescript SK+ คิดเป็นปริมาณ 12% ของปริมาณโปรตีน ทั้งหมดในเซลล์โปรตีนที่ผลิตได้นี้จะสะสมอยู่ใน โซโตพลาสซึมของเซลล์เจ้าบ้านในรูปของอินคลูชั่นบอดี้ ซึ่ง มีขนาดโมเลกุง 19,000 ดาลตัน เท่ากับขนาดของโปรตีนที่ออก แบบไว้ (14,643 ดาลตัน) รวมกับปลายอะมิโนของเอนไซม์ เบตา-กาแลคโตไซเดส และที่สำคัญคือ เอนไซม์นี้อยู่ในรูปที่ ไม่มี activity จึงต้องใช้กัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์, ยูเรีย และ CtAB เพื่อละลายเอ็นไซม์ออกมาจากอินคลูชั่นบอดี้ และ ทำให้เอนไซม์คืนสู่สภาพที่มี activity ผลการวิจัยชี้ให้ เห็นว่าเอ็นไซม์ที่ผ่านกระบวนการดังกล่าวโดยใช้ CTAB จะมี activity สูงกว่าที่ใช้ยูเรียหรือกัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์และเอ็นไซม์ที่ผ่านกระบวนการคืนสภาพโดยใช้ CTAB จะมี activity สูงกว่าเอนไซม์ตัวเดียวกันที่แสดงออกโดยสายยีน ธรรมชาติกว่า 3.7 เท่า
ยีนสำหรับสร้างเอ็นไซม์ไลเปสจากแบคทีเรียทนความร้อน สายพันธุ์ TL71 ถูกตัดต่อเชื่อมกับดีเอ็นเอพาหะ pUC18 และถูกแสดงออกในเชื้อแบคทีเรียชนิด Escherichia coli พบว่าโคลน pUCTL71-1 สามารถสร้างเอ็นไซม์ไลเปสและหลั่ง ออกมานอกเซลล์สะสมในอาหารเลี้ยงเชื้อปริมาณสูง วิทยานิพนธ์นี้กล่าวถึงการทำให้เอ็นไซม์นี้บริสุทธิ์โดย ผ่านอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเอ็นไซม์สะสมอยู่ลงในคอลัมน์ ฟินิลเซฟาโรสซีแอลสี่บี และคอมลัมน์ดีอีเออีเซลลูโลส ตามลำดับ ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า เอ็นไซม์ไลเปสมีความ บริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 276 เท่า มีปริมาณ activity หลงเหลือ เป็น 68.8% และมี specific activity เท่ากับ 11,452 ยูนิต ต่อมิลลิกรัมโปรตีน เมื่อทำการศึกษาขนาดของเอ็นไซม์นี้ โดยใช้คอลัมน์เซฟาเด็กซ์จี 100 พบว่ามีขนาดใหญ่กว่า 100,000 ดาลตัน แต่มีขนาด 38,000 ดาลตัน เมื่อทำการวิ่ง วุ้นโพลีอะคริละไมด์ที่มี SDS เป็นส่วนประกอบ และยังค้นพบ ต่อไปอีกว่า แถบโปรตีนขนาด 38,000 ดาลตันที่ได้หลังการ วิ่งวุ้นโพลีอะคริละไมด์เท่านั้นจึงจะแสดงสมบัติของ เอ็นไซม์ไลเปสหลังจากกำจัด SDS ออกจากแผ่นวุ้นแล้ว จึงสรุปได้ว่าเอ็นไซม์ไลเปสเป็น โมเลกุลเดี่ยวที่มีขนาด 38,000 ดาลตัน ซึ่งจะเกาะกลุ่มกันเป็นก้อนขนาดใหญ่กว่า 100,000 ดาลตัน ในภาวะที่ไม่มี SDS อย่างไรก็ตามเอ็นไซม์นี้ ยังคงแสดงสมบัติของเอ็นไซม์ไลเปส โดยการย่อยโมเลกุลของ สับสเตรทชนิดน้ำมันมะกอกหรือ p-NPP ทั้งเอ็นไซม์ที่ อยู่ในรูปโมเลกุลเดี่ยวหรือเกาะกลุ่มกันเป็นก้อน นอกจาก นี้ยังพบว่า เอ็นไซม์นี้มีค่า pl เท่ากับ 7.75 และเสถียร ในช่วง pH 8-12 ส่วนผลของอุณหภูมิพบว่า เอ็นไซม์นี้ เกิดปฏิกริยาได้ดีที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียสและทนที่ อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสเป็นเวลากว่า 5 วัน โดยยังคงมี activity เหลืออยู่สูงถึง 65% แต่ activity ของเอ็นไซม์ จะลดลงอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูงกว่า 68 องศาเซลเซียส และเมื่อทำการศึกษาผลของสารเคมีต่อ activity ของเอ็นไซม์ พบว่า activity ของเอ็นไซม์จะลดลง 17% เมื่อมี PMSF อยู่เป็นปริมาณ 10 mM ต่อ EDTA ที่ความเข้มข้น 10 mM ไม่มีผลต่อ activity ของเอ็นไซม์เลย แสดงว่ากรดอะมิโนเซรี อาจเกี่ยวข้องกับ active site ของเอ็นไซม์ และไม่ว่า EGTA หรือ CaCl(,2) ที่ความเข้มข้น 10 mM ก็ไม่มีผลต่อ activity ของเอ็นไซม์ ผลการทดลองนี้ชี้ให้เห็นว่า เอ็นไซม์ไลเปสนี้ไม่มีส่วนจับแคลเซียมประกอบในโมเลกุล นอกจากนี้ยังมีผลการทดลองที่แสดงว่า activity ของเอ็นไซม์ จะเพิ่มขึ้นประมาณ 2 เท่า เมื่อมี 4% Triton X-100 หรือ 3M ยูเรียผสมอยู่ และ activity ของเอ็นไซม์จะลดลงทันทีที่ มี SDS เข้มข้นมากว่า 1% สายยีนสังเคราะห์สำหรับเอ็นไซม์ไลเปส (JPLip1) ได้ถูกออกแบบและสังเคราะห์ขึ้นโดยมีพื้นฐานจากลำดับ กรดอะมิโนของเชื้อซูโดโมแนสฟราจี สายพันธุ์ IFO 3458 แต่จากการตรวจสอบพบว่า ลำดับเบสบนสายยีนสังเคราะห์ ดังกล่าวยังมีความผิดพลาดอยู่ วิทยานิพนธ์นี้จึงกล่าวถึง การซ่อมแซมสายยีนสังเคราะห์ JPLip 1 จนกระทั่งได้สายยีน สังเคราะห์ JPLip 2 ที่มีลำดับเบสเหมือนกับ JPLip 1 เว้นแต่มีการกลายของเบสที่ตำแหน่ง 156 จาก A เป็น G และตำแหน่ง 172 จาก T เป็น A ซึ่งการกลายดังกล่าวไม่มี ผลกระทบต่อลำดับกรดอะมิโนของเอนไซม์ตามที่ออกแบบไว้แต่แรก สายยีนสังเคราะห์ JPLip 2 สามารถผลิตโปรตีนในเชื้อ แบคทีเรียเจ้าบ้านชนิด Escherichia coli สายพันธ์ jM 109 ภายใต้การควบคุมของยีน lac Z ที่เป็นส่วนหนึ่งของดีเอ็นเอ พาหะ pBluescript SK+ คิดเป็นปริมาณ 12% ของปริมาณโปรตีน ทั้งหมดในเซลล์โปรตีนที่ผลิตได้นี้จะสะสมอยู่ใน โซโตพลาสซึมของเซลล์เจ้าบ้านในรูปของอินคลูชั่นบอดี้ ซึ่ง มีขนาดโมเลกุง 19,000 ดาลตัน เท่ากับขนาดของโปรตีนที่ออก แบบไว้ (14,643 ดาลตัน) รวมกับปลายอะมิโนของเอนไซม์ เบตา-กาแลคโตไซเดส และที่สำคัญคือ เอนไซม์นี้อยู่ในรูปที่ ไม่มี activity จึงต้องใช้กัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์, ยูเรีย และ CtAB เพื่อละลายเอ็นไซม์ออกมาจากอินคลูชั่นบอดี้ และ ทำให้เอนไซม์คืนสู่สภาพที่มี activity ผลการวิจัยชี้ให้ เห็นว่าเอ็นไซม์ที่ผ่านกระบวนการดังกล่าวโดยใช้ CTAB จะมี activity สูงกว่าที่ใช้ยูเรียหรือกัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์และเอ็นไซม์ที่ผ่านกระบวนการคืนสภาพโดยใช้ CTAB จะมี activity สูงกว่าเอนไซม์ตัวเดียวกันที่แสดงออกโดยสายยีน ธรรมชาติกว่า 3.7 เท่า
Description
Biochemistry (Mahidol University 1996)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Biochemistry
Degree Grantor(s)
Mahidol University