Studies on the purification and characterization of penicillin G acylase from Bacillus megaterium pBA 402/5
2
Issued Date
2024
Copyright Date
1996
Resource Type
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xiv, 130 leaves : ill. (some col.)
Access Rights
open access
Rights
ผลงานนี้เป็นลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยมหิดล ขอสงวนไว้สำหรับเพื่อการศึกษาเท่านั้น ต้องอ้างอิงแหล่งที่มา ห้ามดัดแปลงเนื้อหา และห้ามนำไปใช้เพื่อการค้า
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (M.Sc. (Biotechnology))--Mahidol University, 1996
Suggested Citation
Ampa Sriinkaew Studies on the purification and characterization of penicillin G acylase from Bacillus megaterium pBA 402/5. Thesis (M.Sc. (Biotechnology))--Mahidol University, 1996. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/99301
Title
Studies on the purification and characterization of penicillin G acylase from Bacillus megaterium pBA 402/5
Alternative Title(s)
การศึกษาการทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์และคุณสมบัติของเอนไซม์เพนนิซิลลิน จี เอซิเลสจากเชื้อจุลินทรีย์ Bacillus megaterium pBA 402/5
Author(s)
Advisor(s)
Abstract
Penicillin G acylase is an enzyme which hydrolyzes benzylpenicillin to 6-aminopenicillanic acid, a key intermediate in the manufacturing of semisynthetic penicillins. Purification methods of extracellular penicillin G acylase from B. megaterium pBA 402/5 was studied. Various chromatographic method were used including anion exchange chromatography (DEAE-Sephadex A-50), gel filtration (Sephadex G-200), and hydrophobic interaction chromatography (phenyl Sepharose CL-4B). In this study enzyme purification could be achieved by only one chromatographic step (phenyl Sepharose CL-4B). The enzyme was obtained at a high degree of purity with 2.6 fold purification and 76% recovery of enzyme activity. Optimal pH and optimal purification and 76% recovery of enzyme activity. Optimal pH and optimal temperature of the enzyme were 8.6 and 50 degree C respectively. Complete loss of the enzymatic activity occurred when the enzyme was incubated for 90 min at 50 degree C and for 15 h at pH lower than 4 or higher than 11 . Km and Vmax values of the enzyme were 12.5 mM penicillin G and 16.7 unit/ml, respectively. When 6-nitro-3-phenylacetamidobenzoic acid (NIPAB) was used as a substrate, these values were 0.53 mM and 8.20 unit/ml, respectively. Phenylacetic acid was found to be a competitive inhibitor while 6-aminopenicillanic acid was a non-competitive inhibitor. The Arrhenius plot of the enzyme catalysis showed a break at 35 degree C and the activation energies of the enzymatic hydrolysis below and above 35 degree C were 7.29 Kcal.K.(-1)mol(-1) and 1.95 Kcal.K.(-1)mol(-1), respectively. In this study, a covalently linked α and β subunits of the enzyme (called α-β covalent heterodimer) was observed. This heterodimer of 2 peptides had no enzymatic activity and increased in concentration with increasing fermentation time.
เอนไซม์เอนนิซิลลิน จี เอซิเลส เป็นเอนไซม์ที่ใช้ใน การผลิต 6-aminopenicillanic acid ซึ่งเป็นสารตัวกลาง ที่นำมาใช้ในขบวนการผลิตเพนนิซิลลินกึ่งสังเคราะห์ ได้ทำการ ศึกษาขบวนการทำเอนไซม์เพนนิซิลลิน จี เอซิเลส จากเชื้อ Bacillius megaterium pBA 402/5 ให้บริสุทธิ์โดยใช้ วิธีโครมาโตกราฟฟีหลายวิธี เช่น anion exchange โครมาโตกราฟฟีโดยใช้ DEAE-Sephadex-A-50,gel filtration โครมาโตกราฟฟี โดยใช้ Sephadex-G-200 และ hydrophobic interaction โครมาโตกราฟฟี โดยใช้ phenyl Sepharose CL-4B พบว่าสามารถทำเอนไซม์เพนนิซิลลิน จี เอซิเลสให้ บริสุทธิ์โดยผ่าน column phenyl Sepharose CL-4B เพียง ขั้นตอนเดียว จะทำให้ได้เอนไซม์ที่มีความบริสุทธิ์สูงเมื่อเทียบ กับก่อนการทำให้บริสุทธิ์ถึง 2.6 เท่าและได้ปริมาณเอนไซม์ กลับคืนถึง 76% จากการศึกษาหาค่า pH และอุณหภูมิที่ เหมาะสมในการเร่งปฏิกริยาพบว่ามีค่า pH 8.6 และอุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียสตามลำดับ และเมื่อทำการอบเอนไซม์ที่ อุณหภูมินี้เป็นเวลา 90 นาที หรืออบเอนไซม์ในบัฟเฟอร์ที่มี ค่า pH ต่ำกว่า 4 หรือสูงกว่า 11 เป็นเวลา 15 ชั่วโมง จะทำให้เอนไซม์สูญเสียความสามารถในการเร่งปฏิกริยาอย่าง สิ้นเชิง เมื่อใช้เพนนิซิลลิน จี เป็นสับสเตรท สามารถคำนวณ หาค่า Km ได้เท่ากับ 12.5 mM และค่า Vmax เท่ากับ 16.7 unit/ml ตามลำดับ แต่เมื่อใช้ 6-nitro-3-phenylacetamidobenzoic acid (NIPAB) เป็นสับสเตรทค่า Km มีค่าเท่ากับ 0.53 mM และค่า Vmax มีค่าเท่ากับ 8.20 unit/ml จากการศึกษานี้ พบว่า Phenylacetic acid มีคุณสมบัติเป็น competitive inhibitor ส่วน 6-aminopenicillanic acid มีคุณสมบัติ เป็น noncompetitive inhibitor และสามารถคำนวณหา ค่าพลังงานสำหรับเร่งการเกิดปฏิกิริยา (activation energy) มีค่าเท่ากับ 7.29 Kcal. K.(-1).mol(-1) ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 35 องศาเซลเซียส และที่อุณหภูมิมากกว่า 35 องศาเซลเซียส มีค่าเท่ากับ 1.95 Kcal.K.(-1).mol(-1). การศึกษานี้พบว่ามี heterodimer ที่เชื่อม α และ β subunits ของเอนไซม์ด้วยพันฑะ covalent และเรียกว่า "α-β covalent heterodimer" ไม่พบว่าสารนี้มี activity ของเอนไซม์ และจะมีปริมาณเพิ่มมากขึ้นตามการ เพิ่มเวลา fermentation.
เอนไซม์เอนนิซิลลิน จี เอซิเลส เป็นเอนไซม์ที่ใช้ใน การผลิต 6-aminopenicillanic acid ซึ่งเป็นสารตัวกลาง ที่นำมาใช้ในขบวนการผลิตเพนนิซิลลินกึ่งสังเคราะห์ ได้ทำการ ศึกษาขบวนการทำเอนไซม์เพนนิซิลลิน จี เอซิเลส จากเชื้อ Bacillius megaterium pBA 402/5 ให้บริสุทธิ์โดยใช้ วิธีโครมาโตกราฟฟีหลายวิธี เช่น anion exchange โครมาโตกราฟฟีโดยใช้ DEAE-Sephadex-A-50,gel filtration โครมาโตกราฟฟี โดยใช้ Sephadex-G-200 และ hydrophobic interaction โครมาโตกราฟฟี โดยใช้ phenyl Sepharose CL-4B พบว่าสามารถทำเอนไซม์เพนนิซิลลิน จี เอซิเลสให้ บริสุทธิ์โดยผ่าน column phenyl Sepharose CL-4B เพียง ขั้นตอนเดียว จะทำให้ได้เอนไซม์ที่มีความบริสุทธิ์สูงเมื่อเทียบ กับก่อนการทำให้บริสุทธิ์ถึง 2.6 เท่าและได้ปริมาณเอนไซม์ กลับคืนถึง 76% จากการศึกษาหาค่า pH และอุณหภูมิที่ เหมาะสมในการเร่งปฏิกริยาพบว่ามีค่า pH 8.6 และอุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียสตามลำดับ และเมื่อทำการอบเอนไซม์ที่ อุณหภูมินี้เป็นเวลา 90 นาที หรืออบเอนไซม์ในบัฟเฟอร์ที่มี ค่า pH ต่ำกว่า 4 หรือสูงกว่า 11 เป็นเวลา 15 ชั่วโมง จะทำให้เอนไซม์สูญเสียความสามารถในการเร่งปฏิกริยาอย่าง สิ้นเชิง เมื่อใช้เพนนิซิลลิน จี เป็นสับสเตรท สามารถคำนวณ หาค่า Km ได้เท่ากับ 12.5 mM และค่า Vmax เท่ากับ 16.7 unit/ml ตามลำดับ แต่เมื่อใช้ 6-nitro-3-phenylacetamidobenzoic acid (NIPAB) เป็นสับสเตรทค่า Km มีค่าเท่ากับ 0.53 mM และค่า Vmax มีค่าเท่ากับ 8.20 unit/ml จากการศึกษานี้ พบว่า Phenylacetic acid มีคุณสมบัติเป็น competitive inhibitor ส่วน 6-aminopenicillanic acid มีคุณสมบัติ เป็น noncompetitive inhibitor และสามารถคำนวณหา ค่าพลังงานสำหรับเร่งการเกิดปฏิกิริยา (activation energy) มีค่าเท่ากับ 7.29 Kcal. K.(-1).mol(-1) ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 35 องศาเซลเซียส และที่อุณหภูมิมากกว่า 35 องศาเซลเซียส มีค่าเท่ากับ 1.95 Kcal.K.(-1).mol(-1). การศึกษานี้พบว่ามี heterodimer ที่เชื่อม α และ β subunits ของเอนไซม์ด้วยพันฑะ covalent และเรียกว่า "α-β covalent heterodimer" ไม่พบว่าสารนี้มี activity ของเอนไซม์ และจะมีปริมาณเพิ่มมากขึ้นตามการ เพิ่มเวลา fermentation.
Description
Biotechnology (Mahidol University 1996)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Biotechnology
Degree Grantor(s)
Mahidol University