Studies on the purification and characterization of penicillin G acylase from Bacillus megaterium pBA 402/5

Abstract

Penicillin G acylase is an enzyme which hydrolyzes benzylpenicillin to 6-aminopenicillanic acid, a key intermediate in the manufacturing of semisynthetic penicillins. Purification methods of extracellular penicillin G acylase from B. megaterium pBA 402/5 was studied. Various chromatographic method were used including anion exchange chromatography (DEAE-Sephadex A-50), gel filtration (Sephadex G-200), and hydrophobic interaction chromatography (phenyl Sepharose CL-4B). In this study enzyme purification could be achieved by only one chromatographic step (phenyl Sepharose CL-4B). The enzyme was obtained at a high degree of purity with 2.6 fold purification and 76% recovery of enzyme activity. Optimal pH and optimal purification and 76% recovery of enzyme activity. Optimal pH and optimal temperature of the enzyme were 8.6 and 50 degree C respectively. Complete loss of the enzymatic activity occurred when the enzyme was incubated for 90 min at 50 degree C and for 15 h at pH lower than 4 or higher than 11 . Km and Vmax values of the enzyme were 12.5 mM penicillin G and 16.7 unit/ml, respectively. When 6-nitro-3-phenylacetamidobenzoic acid (NIPAB) was used as a substrate, these values were 0.53 mM and 8.20 unit/ml, respectively. Phenylacetic acid was found to be a competitive inhibitor while 6-aminopenicillanic acid was a non-competitive inhibitor. The Arrhenius plot of the enzyme catalysis showed a break at 35 degree C and the activation energies of the enzymatic hydrolysis below and above 35 degree C were 7.29 Kcal.K.(-1)mol(-1) and 1.95 Kcal.K.(-1)mol(-1), respectively. In this study, a covalently linked α and β subunits of the enzyme (called α-β covalent heterodimer) was observed. This heterodimer of 2 peptides had no enzymatic activity and increased in concentration with increasing fermentation time.

เอนไซม์เอนนิซิลลิน จี เอซิเลส เป็นเอนไซม์ที่ใช้ใน การผลิต 6-aminopenicillanic acid ซึ่งเป็นสารตัวกลาง ที่นำมาใช้ในขบวนการผลิตเพนนิซิลลินกึ่งสังเคราะห์ ได้ทำการ ศึกษาขบวนการทำเอนไซม์เพนนิซิลลิน จี เอซิเลส จากเชื้อ Bacillius megaterium pBA 402/5 ให้บริสุทธิ์โดยใช้ วิธีโครมาโตกราฟฟีหลายวิธี เช่น anion exchange โครมาโตกราฟฟีโดยใช้ DEAE-Sephadex-A-50,gel filtration โครมาโตกราฟฟี โดยใช้ Sephadex-G-200 และ hydrophobic interaction โครมาโตกราฟฟี โดยใช้ phenyl Sepharose CL-4B พบว่าสามารถทำเอนไซม์เพนนิซิลลิน จี เอซิเลสให้ บริสุทธิ์โดยผ่าน column phenyl Sepharose CL-4B เพียง ขั้นตอนเดียว จะทำให้ได้เอนไซม์ที่มีความบริสุทธิ์สูงเมื่อเทียบ กับก่อนการทำให้บริสุทธิ์ถึง 2.6 เท่าและได้ปริมาณเอนไซม์ กลับคืนถึง 76% จากการศึกษาหาค่า pH และอุณหภูมิที่ เหมาะสมในการเร่งปฏิกริยาพบว่ามีค่า pH 8.6 และอุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียสตามลำดับ และเมื่อทำการอบเอนไซม์ที่ อุณหภูมินี้เป็นเวลา 90 นาที หรืออบเอนไซม์ในบัฟเฟอร์ที่มี ค่า pH ต่ำกว่า 4 หรือสูงกว่า 11 เป็นเวลา 15 ชั่วโมง จะทำให้เอนไซม์สูญเสียความสามารถในการเร่งปฏิกริยาอย่าง สิ้นเชิง เมื่อใช้เพนนิซิลลิน จี เป็นสับสเตรท สามารถคำนวณ หาค่า Km ได้เท่ากับ 12.5 mM และค่า Vmax เท่ากับ 16.7 unit/ml ตามลำดับ แต่เมื่อใช้ 6-nitro-3-phenylacetamidobenzoic acid (NIPAB) เป็นสับสเตรทค่า Km มีค่าเท่ากับ 0.53 mM และค่า Vmax มีค่าเท่ากับ 8.20 unit/ml จากการศึกษานี้ พบว่า Phenylacetic acid มีคุณสมบัติเป็น competitive inhibitor ส่วน 6-aminopenicillanic acid มีคุณสมบัติ เป็น noncompetitive inhibitor และสามารถคำนวณหา ค่าพลังงานสำหรับเร่งการเกิดปฏิกิริยา (activation energy) มีค่าเท่ากับ 7.29 Kcal. K.(-1).mol(-1) ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 35 องศาเซลเซียส และที่อุณหภูมิมากกว่า 35 องศาเซลเซียส มีค่าเท่ากับ 1.95 Kcal.K.(-1).mol(-1). การศึกษานี้พบว่ามี heterodimer ที่เชื่อม α และ β subunits ของเอนไซม์ด้วยพันฑะ covalent และเรียกว่า "α-β covalent heterodimer" ไม่พบว่าสารนี้มี activity ของเอนไซม์ และจะมีปริมาณเพิ่มมากขึ้นตามการ เพิ่มเวลา fermentation.