Identification of Biomarkers in Burkholderia Pseudomallei using Whole-Cell Maldi-TOF MS
Issued Date
2023
Copyright Date
2016
Language
eng
File Type
application/pdf
No. of Pages/File Size
xvii, 156 leaves : col. ill.
Access Rights
restricted access
Rights Holder(s)
Mahidol University
Bibliographic Citation
Thesis (Ph.D. (Biochemistry))--Mahidol University, 2016
Suggested Citation
Suthamat Niyompanich Identification of Biomarkers in Burkholderia Pseudomallei using Whole-Cell Maldi-TOF MS. Thesis (Ph.D. (Biochemistry))--Mahidol University, 2016. Retrieved from: https://repository.li.mahidol.ac.th/handle/123456789/89763
Title
Identification of Biomarkers in Burkholderia Pseudomallei using Whole-Cell Maldi-TOF MS
Alternative Title(s)
การระบุหา Biomarkers ในเชื้อแบคทีเรีย Burkholderia Pseudomallei โดยใช้ Whole-Cell Maldi-TOF MS
Author(s)
Abstract
Burkholderia pseudomallei is a pathogenic bacterium causing melioidosis, which is a serious human infectious disease with high mortality rates. Rapid identification and classification of B. pseudomallei from various sources could be advantageous for epidemiological tracking, medical prevention, and treatment of melioidosis. The whole-cell matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (whole- cell MALDI-TOF MS), a recently developed proteomics-based bacterial identification approach, could be employed for a rapid, robust, and accurate identification of B. pseudomallei. In this study, eleven isolates of B. pseudomallei collected from environmental and clinical sources were initially used for the whole-cell MALDI-TOF MS analyses; these included five environmental and six clinical isolates. The morphological appearance of most of these bacterial samples was purple, dry, and rough and was classified as morphotype I B. pseudomallei. By whole- cell MALDI-TOF MS approach, these bacteria were reliably identified as B. pseudomallei, based on five taxon- specific biomarkers and the identification scores obtained from BioTyper analysis. Cluster analysis of the environmental and clinical isolates revealed that six out of eleven isolates were correctly clustered according to their isolation sources. Upon further analysis using ClinProTools software, ten source-specific biomarkers were obtained according to their respective sources. Among these, six biomarkers (m/z 4056, 4214, 5814, 7545, 7895, and 8112 Da) were detected specific for the isolates of environmental source, and four (m/z 3658, 6322, 7035, and 7984 Da) were specific for clinical source. The clinical isolate-specific biomarkers were also observed in three laboratory-constructed rpoS, ppk, and bpsI mutants of clinical isolates that possessed single gene mutations in their respective gene locations, confirming their source of origin. Cluster analysis indicated that the wild-type PP844 reference strain, rpoS, ppk, and bpsI strains were separately dispersed. Thus the whole-cell MALDI-TOF MS method could distinguish B. pseudomallei isolates originated from either environmental or clinical sources as well as mutants bearing genetic changes. Moreover, subsequent ClinProTools analysis could identify the potential biomarkers specific to each of the three mutants. In this respect, a total of twelve candidate biomarkers were discovered, specific for each of the three mutant strains. These biomarkers included m/z 2721 and 2748 Da which were specific for the rpoS mutant, m/z 3150, 3378, and 7994 Da for ppk, and seven mass peaks at m/z 3420, 3520, 3587, 3688, 4623, 4708, and 5450 Da for bpsI. The present study is thus the first to establish and identify the source-specific and mutant-specific biomarkers for the identification and classification of B. pseudomallei based on whole-cell MALDI-TOF MS approach. These findings have also broadened the applicability of the whole-cell MALDI-TOF as a laboratory-based tool to rapidly, accurately, and reproducibly identify extensive libraries of the genetically modified bacteria.
Burkholderia pseudomallei เป็นเชื้อแบคทีเรียก่อโรค melioidosis ซึ่งเป็นโรคติดเชื้อร้ายแรงที่ก่ออัตราการตายสูงในมนุษย์ การระบุสีปีชีส์และจำแนกเชื้อ B. pseudomallei จากแหล่งต่าง ๆ ได้อย่างรวดเร็วนั้น จึงมีประโยชน์ในการช่วยติดตามการแพร่ระบาดของโรค รวมถึงช่วยป้องกันและรักษาผู้ป่วยติดเชื้อได้ดียิ่งขึ้น ดังนั้นจึงได้นำเทคนิค whole-cell MALDI-TOF MS ซึ่งเป็นเทคนิคที่พัฒนาใหม่ทาง proteomics มาใช้ทดสอบ เพื่อจะสามารถระบุสปีชีส์ของเชื้อ B. pseudomallei ได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำ ในการศึกษาครั้งนี้ เชื้อ B. pseudomallei จานวน 11 สายพันธุ์ที่คัดแยกจากสิ่งแวดล้อม 5 สายพันธุ์และคัดแยกจากผู้ป่วย 6 สายพันธุ์ถูกใช้ทดสอบเบื้องต้นด้วยวิธี whole-cell MALDI-TOF MS ซึ่งพบว่าแบคทีเรียส่วนมากมีลักษณะโคโลนีแบบ morphotype I คือ มีสีม่วง ผิวโคโลนีแห้งและขรุขระ และจากการวิเคราะห์ด้วยวิธี whole-cell MALDI-TOF MS พบว่าเชื้อแบคทีเรียทั้งหมดถูกระบุเป็นสปีชีส์ B. pseudomallei ได้อย่างถูกต้องด้วยการตรวจหา 5 biomarkers ที่จาเพาะต่อสปีชีส์ B. pseudomallei (taxon-specific biomarkers) และค่าคะแนนที่ได้จากการวิเคราะห์ด้วยโปรแกรม BioTyper ส่วนผลวิเคราะห์การจัดกลุ่มของเชื้อดังกล่าวซึ่งคัดแยกจากสิ่งแวดล้อมและผู้ป่วย พบว่ามีเชื้อจำนวนทั้งหมด 6 สายพันธุ์ที่สามารถถูกจัดกลุ่มได้ตรงตามแหล่งคัดแยก และผลจากโปรแกรม ClinProTools พบว่ามีทั้งหมด 10 biomarkers ที่จำเพาะต่อแหล่งคัดแยก (source-specific biomarkers) แบ่งเป็น 6 biomarkers ได้แก่ m/z 4056, 4214, 5814, 7545, 7895 และ 8112 Da ที่จำเพาะต่อกลุ่มเชื้อที่คัดแยกจากสิ่งแวดล้อม และ 4 biomarkers ที่จำเพาะต่อกลุ่มที่คัดแยกจากผู้ป่วย (m/z 3658, 6322, 7035 และ 7984 Da) นอกจากนี้ยังพบ biomarkers ที่จำเพาะต่อเชื้อที่คัดแยกมาจากผู้ป่วย (clinical isolate-specific biomarkers) ในเชื้อกลายพันธุ์ทั้ง 3 ชนิด ได้แก่ สายพันธุ์ rpoS, ppk และ bpsI ซึ่งเชื้อเหล่านี้เริ่มต้นมาจากสายพันธุ์ปกติที่คัดแยกมาจากผู้ป่วยและถูกดัดแปลงพันธุกรรมให้กลายพันธุ์ในตาแหน่งยีนดังกล่าว จึงเป็นการยืนยันแหล่งที่มาของเชื้อกลายพันธุ์ทั้ง 3 ชนิดนี้ ผลการจัดกลุ่มระหว่างเชื้อสายพันธุ์ปกติ PP844 และเชื้อกลายพันธุ์ rpoS, ppk และ bpsI พบว่าเชื้อทั้ง 4 สายพันธุ์มีการกระจายตัวแยกออกจากกัน ดังนั้นเทคนิค whole-cell MALDI-TOF MS นี้สามารถจำแนกเชื้อ B. pseudomallei ที่มาจากแหล่งสิ่งแวดล้อมและผู้ป่วยได้ รวมทั้งจำแนกเชื้อที่มีการดัดแปลงพันธุกรรมออกจากเชื้อสายพันธุ์ปกติได้ และได้ตรวจพบ 12 biomarkers ที่จำเพาะต่อเชื้อกลายพันธุ์ทั้ง 3 ดังนี้ biomarkers ที่จำเพาะต่อสายพันธุ์ rpoS ได้แก่ m/z 2721 และ 2748 Da ส่วน biomarkers ที่จำเพาะต่อสายพันธุ์ ppk ได้แก่ 3150, 3378 และ 7994 Da สาหรับสายพันธุ์ bpsI พบทั้งหมด 7 biomarkers ได้แก่ m/z 3420, 3520, 3587, 3688, 4623, 4708 และ 5450 Da การศึกษานี้จึงเป็นครั้งแรกที่นำเทคนิค whole-cell MALDI-TOF MS มาระบุหา biomarkers ที่จำเพาะต่อแหล่งคัดแยก รวมถึงหา biomarkers ที่จำเพาะต่อเชื้อกลายพันธุ์ เพื่อนำมาใช้ประโยชน์ในการระบุสปีชีส์และจำแนกเชื้อ B. pseudomallei นอกจากนี้ยังแสดงถึงความสามารถของการใช้เทคนิคนี้มาเป็นเครื่องมือในห้องปฏิบัติการ เพื่อระบุและจำแนกคลังเชื้อแบคทีเรียที่มีการดัดแปลงพันธุกรรมได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำยิ่งขึ้น
Burkholderia pseudomallei เป็นเชื้อแบคทีเรียก่อโรค melioidosis ซึ่งเป็นโรคติดเชื้อร้ายแรงที่ก่ออัตราการตายสูงในมนุษย์ การระบุสีปีชีส์และจำแนกเชื้อ B. pseudomallei จากแหล่งต่าง ๆ ได้อย่างรวดเร็วนั้น จึงมีประโยชน์ในการช่วยติดตามการแพร่ระบาดของโรค รวมถึงช่วยป้องกันและรักษาผู้ป่วยติดเชื้อได้ดียิ่งขึ้น ดังนั้นจึงได้นำเทคนิค whole-cell MALDI-TOF MS ซึ่งเป็นเทคนิคที่พัฒนาใหม่ทาง proteomics มาใช้ทดสอบ เพื่อจะสามารถระบุสปีชีส์ของเชื้อ B. pseudomallei ได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำ ในการศึกษาครั้งนี้ เชื้อ B. pseudomallei จานวน 11 สายพันธุ์ที่คัดแยกจากสิ่งแวดล้อม 5 สายพันธุ์และคัดแยกจากผู้ป่วย 6 สายพันธุ์ถูกใช้ทดสอบเบื้องต้นด้วยวิธี whole-cell MALDI-TOF MS ซึ่งพบว่าแบคทีเรียส่วนมากมีลักษณะโคโลนีแบบ morphotype I คือ มีสีม่วง ผิวโคโลนีแห้งและขรุขระ และจากการวิเคราะห์ด้วยวิธี whole-cell MALDI-TOF MS พบว่าเชื้อแบคทีเรียทั้งหมดถูกระบุเป็นสปีชีส์ B. pseudomallei ได้อย่างถูกต้องด้วยการตรวจหา 5 biomarkers ที่จาเพาะต่อสปีชีส์ B. pseudomallei (taxon-specific biomarkers) และค่าคะแนนที่ได้จากการวิเคราะห์ด้วยโปรแกรม BioTyper ส่วนผลวิเคราะห์การจัดกลุ่มของเชื้อดังกล่าวซึ่งคัดแยกจากสิ่งแวดล้อมและผู้ป่วย พบว่ามีเชื้อจำนวนทั้งหมด 6 สายพันธุ์ที่สามารถถูกจัดกลุ่มได้ตรงตามแหล่งคัดแยก และผลจากโปรแกรม ClinProTools พบว่ามีทั้งหมด 10 biomarkers ที่จำเพาะต่อแหล่งคัดแยก (source-specific biomarkers) แบ่งเป็น 6 biomarkers ได้แก่ m/z 4056, 4214, 5814, 7545, 7895 และ 8112 Da ที่จำเพาะต่อกลุ่มเชื้อที่คัดแยกจากสิ่งแวดล้อม และ 4 biomarkers ที่จำเพาะต่อกลุ่มที่คัดแยกจากผู้ป่วย (m/z 3658, 6322, 7035 และ 7984 Da) นอกจากนี้ยังพบ biomarkers ที่จำเพาะต่อเชื้อที่คัดแยกมาจากผู้ป่วย (clinical isolate-specific biomarkers) ในเชื้อกลายพันธุ์ทั้ง 3 ชนิด ได้แก่ สายพันธุ์ rpoS, ppk และ bpsI ซึ่งเชื้อเหล่านี้เริ่มต้นมาจากสายพันธุ์ปกติที่คัดแยกมาจากผู้ป่วยและถูกดัดแปลงพันธุกรรมให้กลายพันธุ์ในตาแหน่งยีนดังกล่าว จึงเป็นการยืนยันแหล่งที่มาของเชื้อกลายพันธุ์ทั้ง 3 ชนิดนี้ ผลการจัดกลุ่มระหว่างเชื้อสายพันธุ์ปกติ PP844 และเชื้อกลายพันธุ์ rpoS, ppk และ bpsI พบว่าเชื้อทั้ง 4 สายพันธุ์มีการกระจายตัวแยกออกจากกัน ดังนั้นเทคนิค whole-cell MALDI-TOF MS นี้สามารถจำแนกเชื้อ B. pseudomallei ที่มาจากแหล่งสิ่งแวดล้อมและผู้ป่วยได้ รวมทั้งจำแนกเชื้อที่มีการดัดแปลงพันธุกรรมออกจากเชื้อสายพันธุ์ปกติได้ และได้ตรวจพบ 12 biomarkers ที่จำเพาะต่อเชื้อกลายพันธุ์ทั้ง 3 ดังนี้ biomarkers ที่จำเพาะต่อสายพันธุ์ rpoS ได้แก่ m/z 2721 และ 2748 Da ส่วน biomarkers ที่จำเพาะต่อสายพันธุ์ ppk ได้แก่ 3150, 3378 และ 7994 Da สาหรับสายพันธุ์ bpsI พบทั้งหมด 7 biomarkers ได้แก่ m/z 3420, 3520, 3587, 3688, 4623, 4708 และ 5450 Da การศึกษานี้จึงเป็นครั้งแรกที่นำเทคนิค whole-cell MALDI-TOF MS มาระบุหา biomarkers ที่จำเพาะต่อแหล่งคัดแยก รวมถึงหา biomarkers ที่จำเพาะต่อเชื้อกลายพันธุ์ เพื่อนำมาใช้ประโยชน์ในการระบุสปีชีส์และจำแนกเชื้อ B. pseudomallei นอกจากนี้ยังแสดงถึงความสามารถของการใช้เทคนิคนี้มาเป็นเครื่องมือในห้องปฏิบัติการ เพื่อระบุและจำแนกคลังเชื้อแบคทีเรียที่มีการดัดแปลงพันธุกรรมได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำยิ่งขึ้น
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Department
Faculty of Science
Degree Discipline
Biochemistry
Degree Grantor(s)
Mahidol University