Antiproliferative effect on liver cancer cells of dipterocarpus obtusifolius root

Abstract

Dipterocarpus obtusifolius Teijsm. ex Miq. (local name : Hiang) is a dipterocarpaceous plant. In Thailand, D. obtusifolius root has been used in traditional Thai medicine for the ailments caused by liver cancer. This study aimed to investigate the plant substance with the antiproliferative effect on liver cancer and quantitate it using high-performance liquid chromatography (HPLC). The study began with the isolation of the plant substance from the dichloromethane root extract using silica gel column, with a gradient mobile phase of CH2Cl2/MeOH. The substances DO-1 and DO-2 were isolated. The structures of both compounds were elucidated using spectroscopic analyses. The results revealed that DO-1 was ursolic acid (C30H48O3) with relative molecular mass (Mr) of 456.70 and DO-2 was [beta]-sitosteryl glucoside (C35H60O6) with relative molecular mass (Mr) of 576.44. The antiproliferative effect of DO-1, ethanolic and water root extracts were performed on two liver cancer cell lines (Hep3B and C3A). The results showed the significant antiproliferative activities of DO-1 and ethanolic root extract against Hep3B with ED50 296.42 and 72.75 µg/mL, respectively. In addition, DO-1 showed the antiproliferative activity against human dermal fibroblast (HDF) with ED50 of 52.23 µg/mL. Quantitative analysis by HPLC of DO-1 was established and validated. The optimum HPLC system comprised Hypersil C-18 reversed phase column (250x4.6 mm, i.d. 5 μm), mobile phase using isocratic elution with methanol and 0.2% ammonium acetate in water (83:17), UV detection at 215 nm. The retention time of ursolic acid was 18.9 min. The result showed that the content of ursolic acid (DO-1) in D. obtusifolius root was 0.0047% w/w.

Dipterocarpus obtusifolius Teijsm. ex Miq. ชื่อท้องถิ่น : เหียง เป็นพืชในวงศ์ยาง (Dipterocarpaceae) ในประเทศไทย รากเหียงใช้เป็นส่วนประกอบในตำรับยารักษามะเร็งตับ การศึกษานี้จึงมีจุดประสงค์เพื่อทำการพิสูจน์สารต้านเซลล์มะเร็งตับจากรากเหียง และวิเคราะห์ ปริมาณสารดังกล่าวโดยเทคนิค high performance liquid chromatography (HPLC) การศึกษาเริ่มจากการสกัดแยกสารจากรากเหียงด้วยคอลัมภ์ซิลิกาเจล โดยใช้ไดคลอโรมีเทนและเมทานอลเป็น gradient mobile phase สามารถแยกสารได้ 2 ชนิด ซึ่งเมื่อนำไปพิสูจน์โครงสร้างด้วยวิธีทางสเปกโทรสโกปี พบว่าสาร DO-1 คือ ursolic acid (C30H48O3) มีมวลโมเลกุล (Mr) 456.70 และสาร DO-2 คือ β-sitosteryl glucoside (C35H60O6) มีมวลโมเลกุล (Mr) 576.44 เมื่อทำการทดสอบฤทธิ์ยับยั้งเซลล์มะเร็งตับ (Hep3B และ C3A) ของสาร DO-1, สารสกัดเอทานอลและสารสกัดน้ำของรากเหียง พบว่า สาร DO-1 และสารสกัดเอทานอลของรากเหียง แสดงฤทธิ์ยับยั้ง Hep3B อย่างมีนัยสำคัญด้วยค่า ED50 296.42 µg/mL และ 72.75 µg/mL ตามลำดับ นอกจากนี้สาร DO-1 ยังแสดงฤทธิ์ยับยั้งเซลล์ผิวหนังปกติ (HDF) ด้วยค่า ED50 52.23 µg/mL จากการประเมินวิธีวิเคราะห์ (method validation) พบว่าสภาวะที่เหมาะสมในการวิเคราะห์ปริมาณสาร DO-1 ด้วยวิธี HPLC ประกอบด้วยคอลัมภ์ C-18 Hypersil (250x4.6 mm, i.d. 5 µm) ใช้เมทานอลและสารละลาย 0.2% แอมโมเนียมอะซีเตต เป็นวัฏภาคเคลื่อนที่ อัตราส่วน 83:17, ตรวจวัด UV ที่ความยาวคลื่น 215 นาโนเมตร retention timeของ ursolic acid ปรากฏที่ 18.9 นาที จากการวิเคราะห์ปริมาณ ursolic aid ในรากเหียง พบว่ามีปริมาณ ursolic acid 0.0047% w/w